sPD-1/sPD-L1与Th1/Th2及Th17/Treg相关细胞因子在原发免疫性血小板减少症中的研究①

李姜惠子 刘 洋 王秀娟 孙明玲 庞楠楠 哈力达·亚森 赵 芳 秦玉婷 郭新红

(新疆医科大学第一附属医院血液病中心，新疆维吾尔自治区血液病研究所，乌鲁木齐830000)

原发免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性出血性疾病，约占出血性疾病总数的30%，以外周血血小板计数减少，伴或不伴皮肤黏膜出血为主要临床表现，出血风险随年龄的增长而增加，严重者可有内脏出血甚至颅内出血，危及生命[1]。该病发病机制尚未完全阐明，大量研究显示细胞免疫功能紊乱在该病发病过程中起到重要作用[2-4]。程序性死亡受体1(PD-1)及其配体(PD-L1)是重要的负性协同刺激分子，sPD-1/sPD-L1为其可溶性形式，以往研究发现其在类风湿性关节炎、系统性硬化症、自身免疫性肝炎等多种自身免疫系统疾病中发挥一定作用[5-7]，但在ITP疾病中所起的作用机制尚不明确。本研究通过检测初治ITP患者血清中sPD-1、sPD-L1与相关细胞因子的表达水平，并分析sPD-1与细胞因子的相关性，探讨其在ITP发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2015年1月～2016年6月于新疆医科大学第一附属医院血液病中心住院的ITP患者35例为研究对象，年龄16～66岁，中位年龄42岁，其中男性14名，女性21名。纳入的病例均符合2016年版《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识》的诊断标准[1]，所有患者均为初次发病，排除使用过糖皮质激素或丙种球蛋白治疗者、1月内接受过血小板输注、施行过脾切除术者；同时选取20例同期体检的健康者纳入对照组，年龄16～65岁，中位年龄41岁，其中男性8名，女性12名，年龄、性别等均与病例组无统计学差异，排除自身免疫性疾病、近期感染、肿瘤等疾病。所有受检者在参与研究前均通过伦理委员会认证，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本采集 收集35例ITP患者及20例正常对照组静脉血样本，低速离心机离心(2 500 r/min，10 min)，收集血清并分装于1.5 ml EP管中，放置-80℃冰箱中储存备用。

1.2.2ELISA法检测血清中sPD-1、sPD-L1、IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平 sPD-1、sPD-L1、IFN-γ 、IL-4、IL-17及TGF-β的ELISA试剂盒均购于美国eBioscience公司，严格按照试剂盒说明书操作。取出待测标本室温放置20 min，于各反应孔依次加入50 μl 稀释后的标准品、血清标本、生物素标记的抗体，盖上膜板后振荡混匀，37℃温育1 h，每孔用洗涤液人工洗涤3次，于各反应孔加入亲和链霉素-HRP 80 μl，振荡混匀后于37℃温育30 min，每孔用洗涤液人工洗涤3次，每孔加入50 μl的底物A、B，振荡混匀后于37℃避光温育10 min，取出酶标仪，加入50 μl终止液，读取酶标仪450 nm处吸光度(OD)值，根据绘制的标准曲线计算两组标本中sPD-1、sPD-L1、IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β的浓度。

1.2.3血细胞计数仪检测血小板计数 采集35例ITP患者治疗前及20例正常对照组空腹静脉血样本4 ml，用血细胞计数仪检测血小板计数并对ITP患者血小板计数进行人工复检，取清洁小试管1支加入血小板稀释液0.38 ml，准确吸取静脉血20 μl置于血小板稀释液内，吸取上清液洗3次，立即充分混匀，待完全溶血后再次混匀1 min。取上述均匀的血小板悬液1滴，充入计数池内，静置10～15 min，用高倍镜计数中央大方格内四角和中央共五个中方格内血小板数，根据五个中方格内血小板计数×109/L计算每升血小板数。

2 结果

2.1初治ITP患者外周血中sPD-1、sPD-L1的表达 采用ELISA法分别检测两组血清中sPD-1、sPD-L1水平，初治ITP患者sPD-1水平高于对照组(P=0.008)，差异有统计学意义；sPD-L1水平与对照组无明显变化(P=0.107)，差异无统计学意义，结果表明ITP患者体内存在sPD-1表达增高的现象(表1、图1A)。

2.2初治ITP患者外周血中细胞因子的表达 采用ELISA法分别检测35例初治ITP患者及20例对照组血清中IFN-γ、IL-4、IL-17与TGF-β水平，数据显示初治ITP患者血清中IFN-γ、IL-17水平高于对照组(P=0.031、P=0.005)，差异有统计学意义；IL-4、TGF-β水平低于对照组(P=0.028、P=0.042)，差异有统计学意义，结果表明ITP患者体内存在Th1、Th17型细胞因子增多，Th2、Treg型细胞因子减少，T细胞亚群失衡的现象(表1、图1A)。

2.3初治ITP患者sPD-1与细胞因子的关系 本研究采用ELISA法检测出sPD-1在ITP患者血清中表达增高，IFN-γ、IL-17表达亦增高而IL-4、TGF-β表达降低。通过Pearson法分析初治ITP患者血清中sPD-1与IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β及血小板计数的相关性，数据显示sPD-1与IFN-γ呈正相关(r=0.516,P=0.006)，差异有统计学意义；与血小板计数呈负相关(r=-0.562,P=0.002)，差异有统计学意义；与IL-4、IL-17、TGF-β无相关性(P均>0.05)，差异无统计学意义；进一步分析发现血小板计数与IFN-γ呈负相关(r=-0.531,P=0.004)，差异有统计学意义，结果表明sPD-1、IFN-γ的升高有可能在一定程度上参与了ITP疾病的发生(图1B～D)。

ITP patients(n=35)Healthysubjects(n=20)PGender(Male/Female)14/218/12>0.05Median age(year)42(16-66)41(16-65)>0.05Platelet count(×109/L)17.6±12.2120.0±20.0sPD-1(pg/ml)106.80±32.561)83.57±21.690.008sPD-L1(pg/ml)63.77±20.8254.49±20.200.107IFN-γ(pg/ml)316.48±101.421)249.69±81.130.031IL-4(pg/ml)292.22±89.031)361.48±110.200.028IL-17(pg/ml)10.52±3.301)7.88±2.560.005TGF-β(pg/ml)2 601.70±703.781)3 121.56±938.840.042

Note：Compared with healthy group,1)P<0.05.

图1 血清中相关因子表达水平及sPD-1与IFN-γ和血小板计数的相关性Fig.1 Levels of related factor in serum and correlation between sPD-1,IFN-γ and platelet count

3 讨论

ITP是一种由于体内免疫失衡所导致的自身免疫性疾病，其经典的免疫机制是抗原特异性自身抗体介导的血小板被单核-巨噬细胞过度破坏，但仍有约1/3的患者无法检测到自身抗体，越来越多的研究发现T细胞亚群的比例失衡及其分泌的细胞因子平衡紊乱参与了ITP发病过程[2-4]。

初始CD4+T细胞经第一信号和共刺激信号激活后分化为效应T细胞，通过多种细胞因子以及CD28/B7、CD40/CD154等协同刺激分子与自身反应性B细胞相互作用，促进B细胞增殖分化并大量产生自身抗体，进而持续破坏血小板，导致疾病的发生[8]。PD-1/PD-L1属于CD28/B7家族，是一种抑制T细胞增殖与细胞因子产生的负性调控因子[9]。sPD-1/sPD-L1为PD-1/PD-L1的可溶性形式[10]。Liu等[5]研究发现，在类风湿性关节炎患者血清及滑膜中存在异常高表达的sPD-1，增高的sPD-1可能与mPD-L1发生结合，阻断膜型PD-1/PD-L1信号通路对T细胞的抑制作用，引起机体免疫失控。研究发现，ITP患者外周血单个核细胞中sPD-1转录因子表达量显著增高，血浆中sPD-1的表达也显著增高[11]。我们的研究结果提示ITP患者血清中sPD-1水平高于对照组，这与上述研究结果基本一致。sPD-1可能通过抑制PD-1/PD-L1负性信号通路，减弱免疫抑制信号，从而参与ITP的发病机制[11]。进一步分析发现患者体内sPD-1与血小板计数呈负相关，表明sPD-1升高与血小板破坏严重程度存在一定关系。

以往研究提示Th1细胞及其细胞因子的高表达与ITP疾病发病密切相关[12，13]。根据分泌细胞因子及功能的不同可将初始CD4+T细胞(Th0)分为不同的细胞亚群：Th1细胞主要分泌Th1型细胞因子，包括IFN-γ、TNF、IL-2等，发挥细胞免疫的效应；Th2细胞主要分泌Th2型细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等，可辅助B细胞活化，产生浆细胞及自身抗体，发挥体液免疫的作用；Th1细胞与Th2细胞相互抑制、相互调节。研究发现ITP患者血清中IFN-γ水平升高，ITP可能属于Th1优势应答的免疫反应[14，15]。本研究结果显示ITP患者血清中Th1型细胞因子IFN-γ水平升高，Th2型细胞因子IL-4水平降低，这与郭新红等[14]研究结果基本一致，提示ITP患者体内存在Th1/Th2比例失衡，Th1细胞免疫偏移的现象。Liu等[5]研究发现，在类风湿性关节炎患者血清中sPD-1与IFN-γ、TNF-α等细胞因子表达水平存在正相关，可能与疾病的严重程度有一定关系。我们的研究结果提示ITP患者外周血中sPD-1与IFN-γ呈正相关，与上述研究结果基本一致，提示sPD-1升高能够促进Th1型细胞因子的分泌。进一步分析发现血小板计数与IFN-γ呈负相关，IFN-γ升高可能在一定程度上与血小板破坏程度有关。

近年来研究发现Th17细胞在ITP中比例显著增高，与Th1细胞发挥协同作用[16]。Treg细胞数量减少和免疫抑制功能减弱在ITP发病机制中发挥重要作用[17]。本研究结果显示ITP患者血清中IL-17水平升高，TGF-β水平降低。Yazdanbakhsh等[12]研究发现Th17/Treg比例失衡导致ITP患者体内免疫失衡，可能参与了ITP疾病的发生。Th17细胞主要通过分泌特异性IL-17刺激多种细胞参与机体免疫防御，Treg可通过分泌TGF-β、IL-10等细胞因子发挥免疫抑制和免疫调节的作用。本研究发现Th17型细胞因子升高，而Treg型细胞因子降低，提示Treg细胞的减少可能会打破机体的免疫平衡，导致机体免疫抑制功能减弱，T细胞异常激活，Th17/Treg失衡可能在ITP的发病机制中发挥一定作用。研究发现sPD-1与IL-17呈正相关，同时可抑制Treg细胞[5，18]。我们的结果并未发现sPD-1与IL-17、TGF-β存在相关性，这与上述研究结果不一致，考虑可能在ITP患者体内不只存在PD-1/PD-L1负性共刺激分子这一种调节机制，或存在其他调控因素混合影响，具体机制仍需进一步探讨。总之，sPD-1与IFN-γ呈正相关，血小板计数与sPD-1、IFN-γ均呈负相关，提示增高的sPD-1可能通过抑制PD-1/PD-L1通路的负性调控作用，使Th细胞功能未受抑制，导致Th1细胞活性增高。

综上所述，通过本研究发现在ITP患者体内存在Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡、sPD-1表达水平升高的现象，增高的sPD-1可能通过抑制PD-1/PD-L1负性通路，导致T细胞亚群失衡。至于sPD-1对PD-1/PD-L1通路如何发挥作用，将进一步通过完善体外实验进行研究。