高效液相色谱法测定化妆品中辛酰羟肟酸的含量

李法锦，李适炜，刘瑞学，冷群英

（广东芭薇生物科技股份有限公司，广东 广州 510440）

在化妆品中防腐剂的使用是不可或缺的[1]，传统防腐剂在化妆品法津法规日益完善的条件下，防腐剂在化妆品中使用的安全性问题比以往任何时候都更受到社会的关注，但现有替代防腐剂的原料由于成本、相容性和防腐效果等问题得不到较好的推广和应用，化妆品行业需要新的解决方案来满足市场对防腐产品的需 求[2]。所以化妆品制造从而产生了无防腐添加概念。

辛酰羟肟酸可以取代传统防腐剂应用于化妆品中。它在pH值为中性时依旧有效，是抑菌的理想有机酸，而在这个环境中其它大多数防腐剂替代物的功效都不是很理想。辛酰羟肟酸是唯一在酸性到中性全程都保持未电离状态的有机酸。其性质稳定，具有强烈的抑制真菌效果，与绝大多数化妆品原料的兼容性很好[3]。烷基二元醇在个人护理品工业中已经有广泛的应用，其保湿性和安全性已得到普遍接受。同时，部分二元醇还显示出一定抗微生物的效果。辛酰羟肟酸作为防腐剂应用时，应复配细菌和酵母菌抑制剂二元醇类以达到广谱抗菌效果，相互配合互补，提升防腐优势[4-6]。目前在化妆品中测试辛酰羟肟酸的高效液相色谱法很少有文献报道。本文拟建立化妆品中辛酰羟肟酸含量测定的高效液相色谱法，为化妆品中辛酰羟肟酸测定方法的建立提供适用性的参考，进一步规范化妆品中具有防腐作用的原料的合规性使用。

1 实验部分

1. 1 主要试剂与仪器

辛酰羟肟酸标准物质，纯度≥99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。Sartorius BSA224S分析天平（0.1 mg），赛多利斯有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（DAD），安捷伦科技有限公司；KQ-300DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；L-500离心机，湘潭湘仪仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，美国密理博有限公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 色谱条件

液相色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相VA∶VB=55∶45，采用等梯度洗脱程序，柱温为 25 ℃，流动相使用之前用有机滤膜（0.45 μm）过滤；DAD检测波长为220 nm，进样量为10 μL，流速为 1.0 mL/min。流动相需要使用0.45 μm滤膜进行抽滤和超声脱气才能上机使用。

1. 2. 2 标准溶液的配制

准确称取一定质量的辛酰羟肟酸标准物质，用甲醇溶解后转移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，溶液质量浓度为1 g/L。精密吸取辛酰羟肟酸标准液0.10，0.25，0.50，1.00和2.00 mL，分别定容至10 mL，配制得到辛酰羟肟酸质量浓度分别为10，25，50，100和200 mg/L的系列标准溶液，上机前均经0.45 μm滤膜过滤。

1. 2. 3 样品溶液制备

称取样品1 g （精确至0.001 g）于10 mL具塞比色管中（必要时，置于水浴中去除乙醇等挥发性有机溶剂），加乙腈-水溶液（体积比45∶55）至刻度，振摇，超声提取30 min，必要时可高速离心。上机分析前使用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测样液备用。

2 结果与讨论

2. 1 流动相的选择

考察不同有机相与水的混合比例对辛酰羟肟酸出峰情况的影响，分别是乙腈与水（体积比55∶45和45∶55），甲醇与水（体积比60∶40） 3种流动相比例。发现乙腈与水（体积比45∶55）达到很好的分离，峰形良好，乙腈与水（体积比55∶45）目标峰出现拖尾，甲醇与水（体积比60∶40）目标峰峰形良好但响应值偏低。最终选择乙腈与水（体积比45∶55）作为色谱测试的流动相。辛酰羟肟酸标准物质的色谱图如图1所示。

图 1 辛酰羟肟酸的标准色谱图Fig. 1 Standard chromatogram of octyl hydroxamic acid

2. 2 检测波长的选择

通过检测器全波长扫描可以得到目标物质在205～230 nm均有吸收峰。在实验分析中发现同样浓度的样品在205 nm处响应值最大，考虑到样品基质的干扰，选择220 nm作为检测波长，可以达到很好的扫描效果。

2. 3 样品提取方法的选择

2. 3. 1 样品提取溶剂的选择

在相同的色谱条件下，比较了甲醇、乙腈和流动相3种溶剂对不同种类化妆品（膏霜类、乳液类、液体制剂类）的提取效果。结果表明，这3种溶剂对目标物质的提取率没有明显的差异，为消除溶剂效应，选择流动相（乙腈-水溶液体积比45∶55）作为样品超声提取的溶剂。

2. 3. 2 超声提取时间的选择

超声提取的时间会影响样品的提取率，考察了10～60 min不同时间段内超声波的提取率。发现超声提取30 min以上提取率没有明显的增大，而且随着超声时间的延长，也会使超声波仪器内的水温上升，导致溶剂的挥发。综合考虑，选择30 min为超声提取 时间。

2. 4 标准曲线的建立

经HPLC分析后得到标准曲线，以峰面积（y）为纵坐标，标准溶液质量浓度（x，mg/L）为横坐标。结果表明，该方法在10～200 mg/L范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y=11.195 3x+5.710 2（r2=0.999 9）。按S/N=3计算得出方法检出限为5 mg/kg。

2. 5 精密度

考察了10，50和100 mg/L低、中、高3个质量浓度的辛酰羟肟酸标准溶液的精密度，日内分析6次，连续测定6 d，结果见表1。测定日内精密度分别为2.20%，0.92%和0.42%，日间精密度分别为1.67%，0.78%和0.28%，实验证明，该方法精密度高。

2. 6 加标回收

取液体制剂、乳液类和膏霜类3种不同基质的空白样品进行高、中、低3个浓度水平的加标回收实验，按前文实验方法操作，结果见表2。由表2可知，加标回收率为96.28%～101.23%，相对标准偏差（RSD）≤2.43%，结果表明该方法准确可靠，基质无干扰。

2. 7 重现性实验

平行配制6份供试品溶液，在相同条件下上机测量，RSD为0.37 %。实验证明，该方法重现性好。

表 1 辛酰羟肟酸标准溶液的日内和日间稳定性Tab. 1 Intra-day and inter-day stabilities of octyl hydroxamic acid standard solution

表 2 辛酰羟肟酸回收率（n=6）Tab. 2 Recovery of octyl hydroxamic acid （n=6）

2. 8 实际样品测定

应用所建立的测试方法对标识含有辛酰羟肟酸的化妆品样品进行定性定量分析，结果见表3。

表 3 化妆品样品中辛酰羟肟酸的检出情况Tab. 3 De termination of octyl hydroxamic acid in cosmetic samples

2. 9 干扰试验

在化妆品配方中，辛酰羟肟酸一般与苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯其中一个或者两个防腐剂复配使用，通过实验分析，这4种物质在本方法分析当中不存在互相干扰，不影响目标物质的定性与定量。

3 结论

建立了使用高效液相色谱测定化妆品中辛酰羟肟酸的分析方法。该方法精密度良好，不同剂型的样品回收率高，重现性良好，建立的分析方法操作简单，可快速准确地对化妆品样品中辛酰羟肟酸进行定性和定量分析。