UPLC-DAD法同时测定预调鸡尾酒中24种水溶性合成色素

2019-03-08武太鹏张京晨

分析测试学报 2019年2期

武太鹏,张京晨,马康*

(1.中国计量科学研究院，北京 100029；2.中国石化石油化工科学研究院，北京 100083)

色素作为一类重要的食品添加剂，因能赋予食品靓丽的色彩而被广泛应用。色素主要分为天然色素和合成色素两类，其中天然色素为天然产物，一般对人体无害，但价格昂贵，稳定性差；而合成色素具有成本低、色泽鲜艳、性能稳定、色调多、着色力强、使用方便等特点，因此其应用更为广泛。目前我国允许添加的合成色素主要有柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝等，对其使用范围和最大限量标准等有明确规定。而配制酒中允许添加的色素多达37种，其中合成色素有赤藓红、靛蓝、喹啉黄、亮蓝、柠檬黄、日落黄、苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红[1]。合成色素作为化工产品，大多对人体存在一定的危害，如可能导致过敏或致癌等。因此，为保障食品安全必须对食品所含色素的种类及含量进行准确测定。

目前，针对食品中色素的检测方法主要有光谱法[2-5]、毛细管电泳法[6-7]、电化学法[8-11]、薄层色谱法[12]、离子迁移谱法[13]、液相色谱法[14-22]以及色谱-质谱联用法[23-27]等。其中,液相色谱法因具有样品用量少、灵敏度高、分离效果好等优点而应用最多。预调鸡尾酒是近年来兴起的一种酒类饮品，目前尚无预调鸡尾酒中色素检测方法的报道，故建立预调鸡尾酒中色素的快速、高通量、准确测定方法具有重要意义。本文采用固相萃取技术对预调鸡尾酒进行前处理，通过超高效液相色谱-二极管阵列检测器(UPLC-DAD)进行检测，实现了预调鸡尾酒中14种偶氮类色素、4种三苯甲烷类色素、3种氧杂蒽类色素以及萘酚黄S、中性红、荧光红共24种水溶性合成色素的快速测定，填补了预调鸡尾酒中色素检测的空白，为其准确、快速测定提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器(美国Thermo公司)；Fotector-06C型全自动固相萃取仪(美国Reeko公司)；XP205型电子天平(精度为0.01 mg)、E20实验室pH分析仪(瑞士Mettler Toledo公司)；SIGMA 3-18K离心机(德国Sartorius公司)；KQ-300 VDV型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Vortex-Genie 2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；EVA 32型多功能样品浓缩仪(普立泰科仪器有限公司)；Milli-Q型超纯水发生器(美国Millipore公司)。

质量浓度均为0.5 mg/mL的柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、亮蓝标准溶液来自中国计量科学研究院(NIM)。丽春红S、萘酚黄S、橙黄G、固绿、橙黄Ⅳ、吖啶黄、碱性橙2、罗丹明B、结晶紫、亮绿(美国Chem Service公司)；诱惑红(加拿大Toronto Research Chemicals Inc.)；红色2G(美国Sigma-Aldrich公司)；偶氮玉红、胭脂红SX(日本Tokyo Chemical Industry)；中性红(美国Damas-Beta公司)；赤藓红(波兰Department of Dyes and Organic Products in Zgierz)，橙黄Ⅱ(美国Acros Organics公司)；荧光红、酸性红52(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。

乙腈、甲醇、乙酸铵(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Acros Organics公司)；乙酸(色谱纯，德国 CNW Technologies GmbH)；氨水(分析纯，北京化工厂)；实验用水由 Milli-Q纯水系统制备。

1.2 标准溶液的配制

准确称取19种合成色素(除由NIM获得的5种色素标准溶液)固体粉末适量，溶于水中得质量浓度为100 mg/L的储备溶液。取适量该混合标准溶液与由NIM获得的5种合成色素标准溶液混合，得质量浓度为50.0 mg/L的24种合成色素混合标准溶液。逐步稀释，制得0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0、20.0 mg/L的系列混合标准溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 样品预处理

取15 mL预调鸡尾酒样品于离心管中，8 000 r/min离心5 min，取上层清液10.0 mL，40 ℃水浴氮吹10 min，以除去样品中的乙醇。然后置于超声水浴中超声10 min，除去样品中残留的气体。静置10 min后，用水定容至10.0 mL，充分涡旋混匀，以氨水调至pH 6.5。

对经上述处理的预调鸡尾酒样品进行固相萃取，HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg，Waters公司)依次用5 mL甲醇和5 mL 0.1%(体积分数)甲酸水活化，上样，调节流速为1.0 mL/min，用5 mL甲醇-水(15∶85，体积比)进行淋洗，弃去洗脱液，再分别用3 mL甲醇和3 mL氨化甲醇(5%氨水，体积分数)进行洗脱。45 ℃加热氮吹至干，以1.0 mL水复溶，待测。

1.4 实验条件

色谱柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：A为10 mmol/L乙酸铵(pH 6.25)，B为甲醇-乙腈(2∶8，体积比)。梯度洗脱程序：0～12.0 min，4%～50% B；12.0～12.1 min，50%～99% B；12.1～16.5 min，99% B；16.5～17.0 min，99%～4% B。流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1流动相组成本实验以10 mmol/L乙酸铵(pH 6.25)作为水相，甲醇-乙腈混合溶液作为有机相，考察了甲醇与乙腈的体积比(10∶0、2∶8、4∶6、5∶5、6∶4、8∶2)对24种色素分离效果的影响。结果表明，随着有机相中甲醇比例的增加，24种色素的保留时间均延长，当甲醇与乙腈的体积比为2∶8时可获得最佳的分离效果；同时，比较了乙酸铵的浓度(5、10、15 mmol/L)和pH值(5.0～6.8)对24种色素分离效果的影响，最终选择10 mmol/L乙酸铵(pH 6.25)作为水相。

图1 24种合成色素在不同色谱柱下的色谱图

2.1.2色谱柱的选择在相同的流动相条件下，考察了安捷伦Zorbax SB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)、岛津Shim-pack XR-C18(3.0 mm×75 mm,2.2 μm)和Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)3种色谱柱在各自适宜的流速和洗脱梯度下对24种色素的分离效果。结果显示，采用安捷伦Zorbax SB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)和岛津Shim-pack XR-C18(3.0 mm×75 mm,2.2 μm)色谱柱时，无法实现24种色素的全部分离，且峰形差，响应小(图1a、b)；而采用Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色谱柱时，24种色素可完全分离，峰形对称且响应大(图1c)，故选其作为分析柱。

2.1.3梯度条件的优化由于待测色素种类较多，且其保留行为差异明显，故采用梯度洗脱以提高分析效率和分离效果。考察了4种梯度条件下24种色素的分离效果：梯度1：如“1.4”所示。梯度2：0～15.0 min，5%～65% B；15.0～17.0 min，65% B；17.0～17.1 min，65%～5% B。梯度3：0～8.0 min，5%～40% B；8.0～11.0 min，40% B；11.0～14.0 min，40%～65% B；14.0～17.0 min，65% B；17.0～17.1 min，65%～5% B。梯度4：0～12.0 min，5%～55% B；12.0～12.1 min，55%～90% B；12.1～17.0 min，90% B；17.0～17.5 min，90%～5% B。

结果表明，采用梯度3时，中性红和赤藓红无法分离，且分析时间较长；采用梯度2时，中性红和赤藓红未完全分离；采用梯度4时，中性红和赤藓红可实现完全分离，但荧光红和偶氮玉红的分离度减小，无法基线分离；而采用梯度1时，24种色素均可实现完全分离且分析时间短，故采用梯度1的洗脱程序。

2.1.4检测波长的选择待测的偶氮类色素中，柠檬黄、橙黄Ⅱ等分别在420、490 nm附近有最大吸收，其余红色色素的最大吸收波长均在520 nm附近；三苯甲烷类色素中，除结晶紫外，其余3种色素的最大吸收波长均在620 nm附近；氧杂蒽类色素的最大吸收波长均在520 nm附近,而萘酚黄S、中性红、荧光红的最大吸收波长分别在430、460、490 nm附近。因此实验选择在420、490、520、620 nm波长下分别对色素进行检测(表1)。

在上述最佳条件下，16 min内即可实现对24种水溶性合成色素的分离、检测(图2)，且所有色素的分离度均大于2(表1)。

表1 24种合成色素的保留时间、检测波长、线性关系、分离度、检出限及定量下限Table 1 Retention times,detection wavelength,linear relationships,resolutions,LODs and LOQs of 24 synthetic colors

图2 优化条件下24种合成色素的色谱图(5 mg/L)

2.2 线性关系、检出限与定量下限

在优化条件下，对不同质量浓度的24种合成色素混合标准溶液进行测定，分别以峰面积对其质量浓度作图，24种合成色素在0.01～50.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.998 0。分别以3倍信噪比(S/N=3)确定方法检出限(LOD)，10倍信噪比确定定量下限(LOQ)，可得该方法对24种合成色素的LOD为0.66～27.78 μg/L，LOQ为2.19～92.59 μg/L(见表1)。

2.3 精密度及加标回收率

通过计算多次测量结果的相对标准偏差(RSD)对方法的日内与日间精密度进行评价。日内精密度：采用本方法对0.5、5、10 mg/L的24种合成色素混合标准溶液在1 d内连续测定6次，计算峰面积的RSD；日间精密度：对0.5、5、10 mg/L的24种合成色素混合标准溶液，每天进样3次，连续测定5 d，计算峰面积的RSD。结果表明，方法的日内RSD为0.04%～5.3%，日间RSD为0.08%～6.4%(见表2)。

向空白的预调鸡尾酒样品中添加24种合成色素的混合标准溶液，得到低(0.1 mg/L)、中(0.5 mg/L)、高(1 mg/L)3个水平的基质加标溶液，按本方法进行测定，每个加标水平平行处理2个样品，每个样品分别测定3次(表2)。结果表明，在低、中、高3个浓度水平下，除碱性橙2、亮绿和结晶紫外，21种色素的加标回收率分别为71.2%～114%、72.8%～96.3%、70.6%～109%，RSD分别为0.19%～1.5%、0.40%～4.8%、1.5%～6.0%；而碱性橙2、亮绿和结晶紫的加标回收率略低(53.4%～72.5%)，RSD为3.3%～8.9%，可能是由于预调鸡尾酒样品中柠檬酸等成分与这3种色素相结合，导致固相萃取柱对其的吸附量减少;同时这3种色素均为碱性色素，在酸性条件下与吸附剂的吸附能力较弱，从而使其回收率降低。

表2 方法重复性及回收率Table 2 Reproducibility and recovery of the method

the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

表3 食品中合成色素分析方法的检出限比较Table 3 Comparison of method detection limits for synthetic pigments in food ρ/(μg·L-1)

*not detected

2.4 实际样品的检测

采用所建立方法对市售的10种品牌共50余种预调鸡尾酒进行检测，结果表明，除无色(荔枝口味)的预调鸡尾酒样品外，在其余有色的预调鸡尾酒样品中均检出了合成色素，最多的同时检出3种色素。在所测样品中共检出诱惑红、苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄、亮蓝6种合成色素，质量浓度分别为2.05～10.62 mg/L、1.82～10.41 mg/L、0.72～3.88 mg/L、0.04～0.87 mg/L、1.74～10.02 mg/L、0.12～3.48 mg/L，检出的样品数分别为9种、18种、8种、23种、10种、28种。虽未发现违禁使用色素或单种色素超量添加的现象，但目前并未有针对预调鸡尾酒中色素的限量标准，故同时检出多种色素的预调鸡尾酒的安全性有待验证。同时发现，有5种低档价位、2种中档价位共20余种样品存在配料表所标色素与实际添加色素不符的情况。

2.5 本方法与文献方法的比较

将本方法与已报道的文献方法[17-22]进行比较。文献方法可分析的色素为6～16种，分析时间为13～30 min,而本方法在色素数量、分析时间上具有明显优势；与文献[17-19]相比，本方法的分析时间缩短了20%以上。而与文献[20-22]相比，柠檬黄、苋菜红等色素的检出限至少降低了30多倍，文献[20]、[21]、[22]中对柠檬黄的检出限分别为150、190、50 μg/L，而本方法对柠檬黄的检出限为1.09 μg/L(见表3)。