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UPLC-DAD法同时测定预调鸡尾酒中24种水溶性合成色素

2019-03-08武太鹏张京晨

分析测试学报 2019年2期
关键词:柠檬黄鸡尾酒检出限

武太鹏,张京晨,马 康*

(1.中国计量科学研究院,北京 100029;2.中国石化石油化工科学研究院,北京 100083)

色素作为一类重要的食品添加剂,因能赋予食品靓丽的色彩而被广泛应用。色素主要分为天然色素和合成色素两类,其中天然色素为天然产物,一般对人体无害,但价格昂贵,稳定性差;而合成色素具有成本低、色泽鲜艳、性能稳定、色调多、着色力强、使用方便等特点,因此其应用更为广泛。目前我国允许添加的合成色素主要有柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝等,对其使用范围和最大限量标准等有明确规定。而配制酒中允许添加的色素多达37种,其中合成色素有赤藓红、靛蓝、喹啉黄、亮蓝、柠檬黄、日落黄、苋菜红、新红、胭脂红、诱惑红[1]。合成色素作为化工产品,大多对人体存在一定的危害,如可能导致过敏或致癌等。因此,为保障食品安全必须对食品所含色素的种类及含量进行准确测定。

目前,针对食品中色素的检测方法主要有光谱法[2-5]、毛细管电泳法[6-7]、电化学法[8-11]、薄层色谱法[12]、离子迁移谱法[13]、液相色谱法[14-22]以及色谱-质谱联用法[23-27]等。其中,液相色谱法因具有样品用量少、灵敏度高、分离效果好等优点而应用最多。预调鸡尾酒是近年来兴起的一种酒类饮品,目前尚无预调鸡尾酒中色素检测方法的报道,故建立预调鸡尾酒中色素的快速、高通量、准确测定方法具有重要意义。本文采用固相萃取技术对预调鸡尾酒进行前处理,通过超高效液相色谱-二极管阵列检测器(UPLC-DAD)进行检测,实现了预调鸡尾酒中14种偶氮类色素、4种三苯甲烷类色素、3种氧杂蒽类色素以及萘酚黄S、中性红、荧光红共24种水溶性合成色素的快速测定,填补了预调鸡尾酒中色素检测的空白,为其准确、快速测定提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(美国Thermo公司);Fotector-06C型全自动固相萃取仪(美国Reeko公司);XP205型电子天平(精度为0.01 mg)、E20实验室pH分析仪(瑞士Mettler Toledo公司);SIGMA 3-18K离心机(德国Sartorius公司);KQ-300 VDV型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Vortex-Genie 2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司);EVA 32型多功能样品浓缩仪(普立泰科仪器有限公司);Milli-Q型超纯水发生器(美国Millipore公司)。

质量浓度均为0.5 mg/mL的柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、亮蓝标准溶液来自中国计量科学研究院(NIM)。丽春红S、萘酚黄S、橙黄G、固绿、橙黄Ⅳ、吖啶黄、碱性橙2、罗丹明B、结晶紫、亮绿(美国Chem Service公司);诱惑红(加拿大Toronto Research Chemicals Inc.);红色2G(美国Sigma-Aldrich公司);偶氮玉红、胭脂红SX(日本Tokyo Chemical Industry);中性红(美国Damas-Beta公司);赤藓红(波兰Department of Dyes and Organic Products in Zgierz),橙黄Ⅱ(美国Acros Organics公司);荧光红、酸性红52(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。

乙腈、甲醇、乙酸铵(色谱纯,德国Merck公司);甲酸(色谱纯,美国Acros Organics公司);乙酸(色谱纯,德国 CNW Technologies GmbH);氨水(分析纯,北京化工厂);实验用水由 Milli-Q纯水系统制备。

1.2 标准溶液的配制

准确称取19种合成色素(除由NIM获得的5种色素标准溶液)固体粉末适量,溶于水中得质量浓度为100 mg/L的储备溶液。取适量该混合标准溶液与由NIM获得的5种合成色素标准溶液混合,得质量浓度为50.0 mg/L的24种合成色素混合标准溶液。逐步稀释,制得0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0、20.0 mg/L的系列混合标准溶液,置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 样品预处理

取15 mL预调鸡尾酒样品于离心管中,8 000 r/min离心5 min,取上层清液10.0 mL,40 ℃水浴氮吹10 min,以除去样品中的乙醇。然后置于超声水浴中超声10 min,除去样品中残留的气体。静置10 min后,用水定容至10.0 mL,充分涡旋混匀,以氨水调至pH 6.5。

对经上述处理的预调鸡尾酒样品进行固相萃取,HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg,Waters公司)依次用5 mL甲醇和5 mL 0.1%(体积分数)甲酸水活化,上样,调节流速为1.0 mL/min,用5 mL甲醇-水(15∶85,体积比)进行淋洗,弃去洗脱液,再分别用3 mL甲醇和3 mL氨化甲醇(5%氨水,体积分数)进行洗脱。45 ℃加热氮吹至干,以1.0 mL水复溶,待测。

1.4 实验条件

色谱柱:Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流动相:A为10 mmol/L乙酸铵(pH 6.25),B为甲醇-乙腈(2∶8,体积比)。梯度洗脱程序:0~12.0 min,4%~50% B;12.0~12.1 min,50%~99% B;12.1~16.5 min,99% B;16.5~17.0 min,99%~4% B。流速:0.3 mL/min;柱温:35 ℃;进样体积:5 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1流动相组成本实验以10 mmol/L乙酸铵(pH 6.25)作为水相,甲醇-乙腈混合溶液作为有机相,考察了甲醇与乙腈的体积比(10∶0、2∶8、4∶6、5∶5、6∶4、8∶2)对24种色素分离效果的影响。结果表明,随着有机相中甲醇比例的增加,24种色素的保留时间均延长,当甲醇与乙腈的体积比为2∶8时可获得最佳的分离效果;同时,比较了乙酸铵的浓度(5、10、15 mmol/L)和pH值(5.0~6.8)对24种色素分离效果的影响,最终选择10 mmol/L乙酸铵(pH 6.25)作为水相。

图1 24种合成色素在不同色谱柱下的色谱图

2.1.2色谱柱的选择在相同的流动相条件下,考察了安捷伦Zorbax SB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)、岛津Shim-pack XR-C18(3.0 mm×75 mm,2.2 μm)和Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)3种色谱柱在各自适宜的流速和洗脱梯度下对24种色素的分离效果。结果显示,采用安捷伦Zorbax SB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)和岛津Shim-pack XR-C18(3.0 mm×75 mm,2.2 μm)色谱柱时,无法实现24种色素的全部分离,且峰形差,响应小(图1a、b);而采用Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色谱柱时,24种色素可完全分离,峰形对称且响应大(图1c),故选其作为分析柱。

2.1.3梯度条件的优化由于待测色素种类较多,且其保留行为差异明显,故采用梯度洗脱以提高分析效率和分离效果。考察了4种梯度条件下24种色素的分离效果:梯度1:如“1.4”所示。梯度2:0~15.0 min,5%~65% B;15.0~17.0 min,65% B;17.0~17.1 min,65%~5% B。梯度3:0~8.0 min,5%~40% B;8.0~11.0 min,40% B;11.0~14.0 min,40%~65% B;14.0~17.0 min,65% B;17.0~17.1 min,65%~5% B。梯度4:0~12.0 min,5%~55% B;12.0~12.1 min,55%~90% B;12.1~17.0 min,90% B;17.0~17.5 min,90%~5% B。

结果表明,采用梯度3时,中性红和赤藓红无法分离,且分析时间较长;采用梯度2时,中性红和赤藓红未完全分离;采用梯度4时,中性红和赤藓红可实现完全分离,但荧光红和偶氮玉红的分离度减小,无法基线分离;而采用梯度1时,24种色素均可实现完全分离且分析时间短,故采用梯度1的洗脱程序。

2.1.4检测波长的选择待测的偶氮类色素中,柠檬黄、橙黄Ⅱ等分别在420、490 nm附近有最大吸收,其余红色色素的最大吸收波长均在520 nm附近;三苯甲烷类色素中,除结晶紫外,其余3种色素的最大吸收波长均在620 nm附近;氧杂蒽类色素的最大吸收波长均在520 nm附近,而萘酚黄S、中性红、荧光红的最大吸收波长分别在430、460、490 nm附近。因此实验选择在420、490、520、620 nm波长下分别对色素进行检测(表1)。

在上述最佳条件下,16 min内即可实现对24种水溶性合成色素的分离、检测(图2),且所有色素的分离度均大于2(表1)。

表1 24种合成色素的保留时间、检测波长、线性关系、分离度、检出限及定量下限Table 1 Retention times,detection wavelength,linear relationships,resolutions,LODs and LOQs of 24 synthetic colors

图2 优化条件下24种合成色素的色谱图(5 mg/L)

2.2 线性关系、检出限与定量下限

在优化条件下,对不同质量浓度的24种合成色素混合标准溶液进行测定,分别以峰面积对其质量浓度作图,24种合成色素在0.01~50.0 mg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.998 0。分别以3倍信噪比(S/N=3)确定方法检出限(LOD),10倍信噪比确定定量下限(LOQ),可得该方法对24种合成色素的LOD为0.66~27.78 μg/L,LOQ为2.19~92.59 μg/L(见表1)。

2.3 精密度及加标回收率

通过计算多次测量结果的相对标准偏差(RSD)对方法的日内与日间精密度进行评价。日内精密度:采用本方法对0.5、5、10 mg/L的24种合成色素混合标准溶液在1 d内连续测定6次,计算峰面积的RSD;日间精密度:对0.5、5、10 mg/L的24种合成色素混合标准溶液,每天进样3次,连续测定5 d,计算峰面积的RSD。结果表明,方法的日内RSD为0.04%~5.3%,日间RSD为0.08%~6.4%(见表2)。

向空白的预调鸡尾酒样品中添加24种合成色素的混合标准溶液,得到低(0.1 mg/L)、中(0.5 mg/L)、高(1 mg/L)3个水平的基质加标溶液,按本方法进行测定,每个加标水平平行处理2个样品,每个样品分别测定3次(表2)。结果表明,在低、中、高3个浓度水平下,除碱性橙2、亮绿和结晶紫外,21种色素的加标回收率分别为71.2%~114%、72.8%~96.3%、70.6%~109%,RSD分别为0.19%~1.5%、0.40%~4.8%、1.5%~6.0%;而碱性橙2、亮绿和结晶紫的加标回收率略低(53.4%~72.5%),RSD为3.3%~8.9%,可能是由于预调鸡尾酒样品中柠檬酸等成分与这3种色素相结合,导致固相萃取柱对其的吸附量减少;同时这3种色素均为碱性色素,在酸性条件下与吸附剂的吸附能力较弱,从而使其回收率降低。

表2 方法重复性及回收率Table 2 Reproducibility and recovery of the method

the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

表3 食品中合成色素分析方法的检出限比较Table 3 Comparison of method detection limits for synthetic pigments in food ρ/(μg·L-1)

*not detected

2.4 实际样品的检测

采用所建立方法对市售的10种品牌共50余种预调鸡尾酒进行检测,结果表明,除无色(荔枝口味)的预调鸡尾酒样品外,在其余有色的预调鸡尾酒样品中均检出了合成色素,最多的同时检出3种色素。在所测样品中共检出诱惑红、苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄、亮蓝6种合成色素,质量浓度分别为2.05~10.62 mg/L、1.82~10.41 mg/L、0.72~3.88 mg/L、0.04~0.87 mg/L、1.74~10.02 mg/L、0.12~3.48 mg/L,检出的样品数分别为9种、18种、8种、23种、10种、28种。虽未发现违禁使用色素或单种色素超量添加的现象,但目前并未有针对预调鸡尾酒中色素的限量标准,故同时检出多种色素的预调鸡尾酒的安全性有待验证。同时发现,有5种低档价位、2种中档价位共20余种样品存在配料表所标色素与实际添加色素不符的情况。

2.5 本方法与文献方法的比较

将本方法与已报道的文献方法[17-22]进行比较。文献方法可分析的色素为6~16种,分析时间为13~30 min,而本方法在色素数量、分析时间上具有明显优势;与文献[17-19]相比,本方法的分析时间缩短了20%以上。而与文献[20-22]相比,柠檬黄、苋菜红等色素的检出限至少降低了30多倍,文献[20]、[21]、[22]中对柠檬黄的检出限分别为150、190、50 μg/L,而本方法对柠檬黄的检出限为1.09 μg/L(见表3)。

3 结 论

本文采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器,建立了同时测定预调鸡尾酒中24种水溶性合成色素含量的方法。与已报道方法相比,本方法的分析时间缩短了20%以上,且具有分析色素种类多、重现性好、检出限低等优点,已成功应用于50余种预调鸡尾酒实际样品的测定。

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