QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法快速测定土壤中19种氟喹诺酮类抗生素残留

陈 磊,吴赟琦,赵志勇,赵晓燕,周昌艳*

( 1.上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201403；3.河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

氟喹诺酮类抗生素(FQs)被广泛应用于动物和人类感染性疾病的治疗，具有生物活性和累积性，可通过多种途径进入环境[1]，沉积物/土壤的吸附作用是其迁移的主要途径之一[2]。FQs对植物和水生生物有毒，由于其在全球范围内的大量使用以及对土壤的高亲和力，很可能通过植物进入人类食物链，对生态系统和人类健康构成威胁[3]。

QuEChERS是相对较新的样品前处理方法，通常包括乙腈提取、盐析分层和基质分散萃取净化等步骤，已被广泛应用于食品和环境样品的预处理[10]。QuEChERS方法用于测定土壤中有机化合物残留时，一般需加水重构基质条件，采用超声等辅助提取，改进净化材料消除复杂基质干扰，以提高检测方法的回收率[11]。Guo 等[12]开发了QuEChERS-液相色谱-串联质谱测定猪粪中抗生素的方法，其中喹诺酮类抗生素的回收率低，其采用内标法消除基质效应[13]。Zhao 等[14]采用离子交换固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定有机肥料中的抗生素，通过内标法校正环丙沙星和诺氟沙星的定量结果。汪建妹等[15]采用QuEChERS结合柱净化的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定有机肥中的46种抗生素，通过提高缓冲溶液pH值的方法来提升喹诺酮类抗生素的回收率。研究显示，提高缓冲液pH值并不能保证FQs的回收率均较理想[9]。本文建立了QuEChERS前处理结合UPLC-MS/MS快速检测土壤中19种FQs的方法，该方法添加内标物校正，采用超声辅助提取，改进了快速基质分散固相萃取(d-SPE)净化柱，具有较好的实用价值。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

Na2HPO4·2H2O、C6H8O7·H2O(分析纯，上海Macklin公司)，Na2EDTA·2H2O(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)，甲醇、乙腈、乙酸(色谱纯，德国Merck公司)，甲酸(分析纯，美国Sigma-Aldrich公司)，Nylon66滤头(0.22 μm，美国Pall公司)，盐包(上海CNW公司，每袋含4 g硫酸镁、1 g 氯化钠、0.5 g柠檬酸氢二钠、1 g柠檬酸钠)，基质分散固相萃取净化柱(d-SPE，北京广普达公司)，进样瓶(美国Agilent公司)。实验用水由Milli-Q超纯水仪制备。0.1 mol/L EDTA-McIlvaine缓冲液：将15 g Na2HPO4·2H2O、13 g C6H8O7·H2O和36.6 g Na2EDTA·2H2O溶于1 L水中制得[12]。

1.2 仪器与设备

ST-16R高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，多管式旋涡混合器(美国Talboys公司)，2500 TH超声波清洗器(上海安谱公司)，移液枪(日本岛津公司)，N-EVAP112氮吹仪(上海曲晨机电技术公司)，Waters Acquity高效液相色谱仪，C18色谱柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm，美国Waters公司)，Qtrap-5500三重四极杆串联质谱仪(美国SCIEX公司)。

1.3 标准溶液的配制

标准品：氧氟沙星、诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星、甲磺酸达氟沙星、氟甲喹、盐酸二氟沙星、依诺沙星、司帕沙星、奥比沙星、左氧氟沙星水合物、帕珠沙星、安妥沙星、那氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、盐酸沙拉沙星、麻保沙星，以及氘代恩诺沙星(ENR-D5)、氘代诺氟沙星(NOR-D5)、氘代环丙沙星(CIP-D8)，纯度均大于98%，购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司。标准品均以甲醇配制成200～1 000 mg/L的单标储备液，-20 ℃储存，再用甲醇分别配制上述19种抗生素(10 mg/L)和3种内标物(10 mg/L)的混合标准溶液，-20 ℃储存。

定量分析时，除氟甲喹、奥比沙星与那氟沙星不用内标法校正外，其它16种FQs均采用内标法进行校正。其中，氧氟沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、洛美沙星、沙拉沙星和麻保沙星以ENR-D5为内标；诺氟沙星、依诺沙星、帕珠沙星与安妥沙星以NOR-D5为内标；环丙沙星以CIP-D8为内标。

1.4 分析条件

液相色谱条件：柱温为40 ℃，流动相为甲醇(A)、0.1%甲酸水(B)，进样体积为3 μL，流速为0.3 mL/min。流动相洗脱梯度：0～2.0 min，20%A；2.0～5.0 min，20%～30%A；5.0～5.5 min，30%～90%A；5.5～7.0 min，90%～95%A；7.0～7.1 min,95%～20%A；7.1～8.0 min，20%A。

质谱条件：电喷雾电压5.5 kV，离子源温度500 ℃，采用正离子多反应监测模式，气帘气压力：275.6 kPa，碰撞气压力：55.12 kPa，雾化气压力：344.5 kPa。目标抗生素的母离子(Q1)、定性/定量离子(Q3)、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等质谱条件见表1。

表1 19种FQs的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 19 FQs

*quantitative ion

1.5 土壤样品的制备

空白土壤样品采自上海市奉贤区农田0～20 cm的表层土壤，其pH值为7.5，有机质含量为1.6%，经检测未含有目标抗生素。样品经剔除杂物，自然风干后过20目土壤筛(孔径0.83 mm)。

1.6 提取与净化步骤

称取5.0 g样品置于50 mL离心管中，加入200 μg/kg的内标物质，静置1 h，加入10 mL 0.1 mol/L EDTA-McIlvaine缓冲液，涡旋1 min，再加入10 mL乙腈，涡旋1 min后，25 ℃下超声提取15 min，以4 000 r/min离心5 min，将上清液转入50 mL离心管中，并将沉降的土样再次超声提取，收集2次提取后上清液，用0.1 mol/L EDTA-McIlvaine缓冲液与乙腈混合溶剂(体积比1∶1，现配现用)将2次提取液补足至40 mL。加入2袋盐包后，立即密封离心管，剧烈摇动1 min，使上述40 mL提取液分层，以4 000 r/min离心5 min后，吸取2 mL上层清液过d-SPE柱(在5 mL PVC针筒顶端装有150 mg无水MgSO4、15 mg PSA、15 mg C18，填料两端放有隔垫)快速净化。为减少仪器进样的溶剂效应，取过柱后的溶液1 mL置于玻璃试管中，在45 ℃水浴条件下氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(体积比20∶80)复溶，过0.22 μm有机相滤头，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

研究表明[13,15]，C18柱适于氟喹诺酮类抗生素残留的分析，因此本实验对比了T3(1.6 μm,2.1 mm×100 mm)、BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)和HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)3种不同粒径ACQUITY UPLC C18柱的分离效果。结果表明：此3种色谱柱对19种目标物的分离度均较好，其中经BEH C18色谱柱分离后的目标物峰形更好，所以选其作为分离色谱柱。实验还对比了甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时的分离效果，结果显示甲醇-0.1%甲酸水的分离效果和峰形较好，因此选择流动相为甲醇-0.1%甲酸水。

2.2 提取条件的优化

2.2.1提取剂的优化氟喹诺酮类抗生素易与土壤中的金属离子结合，文献[14]通过添加EDTA-McIlvaine缓冲液，使EDTA与金属离子形成络合物，将土壤中的目标化合物游离出来，再添加有机溶剂进行提取。本实验加入10 mL 0.1 mol/L EDTA-McIlvaine缓冲液后，考察了分别加入10 mL的乙腈、甲醇-乙腈(体积比1∶3)、乙腈-乙酸(体积比9∶1)提取剂在25 ℃超声水浴中提取15 min，重复提取2次的回收率。结果表明：乙腈作为提取剂时，19种目标物的回收率均大于66.8%，而经其它2种溶剂提取的部分目标物回收率低于50.0%，因此选择0.1 mol/L EDTA-McIlvaine缓冲液-乙腈(1∶1)作为混合提取剂，提取时先加缓冲液，再加乙腈。

2.2.2提取方式的优化以EDTA-McIlvaine缓冲液和乙腈(1∶1)为提取剂，提取15 min，重复提取2次条件下，对涡旋振荡和25 ℃超声提取2种提取方式进行了比较。结果发现：25 ℃超声提取对各目标物的回收率均大于涡旋振荡提取。因此选择25 ℃超声水浴作为提取方式。

2.2.3提取时间的优化以EDTA-McIlvaine缓冲液和乙腈(1∶1)为提取剂，25 ℃超声提取2次条件下，考察了提取时间(10、15、20 min)的影响。由图1可知，提取时间为10 min时，DIF和ORB的回收率仅为64.4%和53.3%；提取时间为15 min时，目标物的回收率均在70.2%以上，平均回收率为85.1%；提取时间为20 min时，目标物的平均回收率可达88.5%。为节省操作时间，最终选择提取时间为15 min。

2.2.4提取次数的优化以EDTA-McIlvaine缓冲液和乙腈(1∶1)为提取剂、25 ℃超声提取15 min条件下，考察了提取次数(1次、2次、3次)的影响。结果表明：19种目标物的回收率随提取次数的增加而增大，提取1次时目标物的平均回收率为59.3%,提取2次和3次时的平均回收率分别为84.5%和85.4%，为节省实验时间，最终选择提取2次。

2.3 净化条件的优化

土壤经提取后含有杂质，为减少基质效应，提高检测灵敏度，本实验采用d-SPE净化柱进行快速净化。对d-SPE净化柱中装填3种净化材料(无水MgSO4+PSA+C18)的用量组合进行了优化，6种组合分别为[16]：A(100 mg+10 mg+25 mg)、B(100 mg+15 mg+15 mg)、C(100 mg+25 mg+25 mg)、D(100 mg+25 mg+10 mg)、E(150 mg+15 mg +15 mg)、F(150 mg+25 mg+25 mg)。土壤样品加标200 μg/kg后，采用“1.6”方法超声提取2次，加盐分层后，分别移取2 mL上清液，用以上6种组合材料净化。结果表明：当PSA或C18的用量为25 mg时有2～3个抗生素的回收率低于60%；组合E的回收率最高，回收率为73.8%～96.3%，最终选取组合E(150 mg无水MgSO4+15 mg PSA+15 mg C18)作为d-SPE净化剂。

图1 不同提取时间下19种FQs的回收率

2.4 方法验证

2.4.1线性范围为消除基质效应对目标物检测的影响，用样品空白基质配制标准溶液，以目标物的质量浓度(X，μg/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。由表2可知，除了ENO、ANT的线性范围为5.0～200 μg/L，NOR、PEF的线性范围为2.0～100 μg/L外，其余目标物的线性范围均为1.0～100 μg/L；相关系数(r2)为0.992～0.998。

表2 19种FQs的相关系数(r2)、线性范围、检出限、定量下限、回收率与相对标准偏差(n=5)Table 2 Correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs,LOQs,recoveries and RSDs(n=5) for 19 FQs

2.4.2方法检出限与定量下限在空白土壤样品中分别添加0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg/kg的19种FQs混合标准溶液(n=5)，经前处理后上机检测，以各目标物的定性、定量离子质谱图响应值大于3倍信噪比(S/N)时对应的加标水平为方法检出限(LOD)，大于10倍信噪比时对应的加标水平为定量下限(LOQ)，得到土壤中19种FQs的LOD为0.2～1.0 μg/kg，LOQ为1.0～5.0 μg/kg。19种FQs在空白土壤基质标准溶液(5.0 μg/L)中的定量离子提取色谱图见图2，各目标化合物在2.5～7.0 min内出峰，色谱峰形较好。

2.4.3回收率与相对标准偏差在空白土壤样品中添加10、50、200 μg/kg的19种FQs混合标准溶液，每个加标水平设5个重复，回收率和相对标准偏差(RSD)见表2。结果表明：19种FQs在3种加标水平下的回收率为65.2%～104%，平均回收率分别为79.8%、82.6%和85.8%，RSD为1.8%～14%，基本满足GB/T 27404-2008 《实验室质量控制规范 食品理化检测》标准对回收率和RSD的要求[17]，方法适用于实际土壤样品的检测。

2.5 实际样品检测

采用本方法对采自上海市郊区35个不同类型农田的土壤样品中FQs残留进行分析，测得土壤中19种FQs的总含量为9.4～124.9 μg/kg。其中主要是CIP残留，其检出率为100%，检出量为9.4～79.9 μg/kg，平均含量为33.1 μg/kg；其次是NOR、ENR、OFX，检出率分别为71%、57%、31%，平均检出量分别为7.3、7.8、5.0 μg/kg；其它抗生素的检出率均在10%以下，平均检出量均在10 μg/kg以下。Sun 等[18]对长江三角洲地区241个土壤样品检测发现，OFX、ENR、CIP和NOR的总含量平均值为48.8 μg/kg，检出率分别为72%、75%、83%和73%，平均检出量分别为5.86、9.98、27.7、11.2 μg/kg。赵晶等[19]检测发现，上海市崇明岛禽畜养殖场周围土壤中OFX、ENR、CIP和NOR的总含量平均值为 144 μg/kg，OFX、ENR和 CIP 的检出率均为100%，NOR的检出率为 91%，平均检出量分别为8.1、86.8、32.0、17.4 μg/kg。本实验对土壤样品中FQs残留的检测结果与文献一致。虽然本实验中CIP、NOR、ENR和OFX的检出值不高，但检出率较高，为了保障禽畜粪污资源化利用以及农产品质量安全，应对长期或大量施用粪肥和有机肥的农田土壤中上述4种抗生素进行风险评估。

3 结 论

本文建立了QuEChERS/UPLC-MS/MS结合同位素内标法同时测定土壤中19种FQs残留的分析方法，各抗生素的定量下限为1.0～5.0 μg/kg，在10、50、200 μg/kg 3个加标水平下的平均回收率分别为79.8%、82.6%和85.8%，RSD不大于14%。该方法操作简单、快速，准确度较高，能够满足目前土壤中氟喹诺酮类抗生素检测和风险评估的需求。