食品中挥发性硫化物的研究进展

程玉娇，李贵节,2，翟雨淋，王珺，高芳进，刘光兰，RUSSELL LEE ROUSEFF*

1(西南大学柑桔研究所，中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712) 2(重庆第二师范学院，重庆市功能性食品协同创新中心，重庆市功能性食品工程研究中心，重庆，400067) 3(重庆忠县果业局，重庆，404300)

挥发性硫化物(volatile sulfur compounds,VSCs)是一类重要的芳香化学物质，对食品的特征风味或异味的产生具有重要的影响。目前已在多种食品中发现，如：蔬菜中含有异硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate，AITC)、2-仲丁基噻唑、二烯丙基三硫化物等[1-3]，水果中含有1-对孟烯-8-硫醇、3-巯基己酸戊酯、4-甲氧基-2-甲基-2-丁硫醇等[4-6]，肉制品及海鲜制品含有2-甲基-3-呋喃硫醇(2-methyl-3-furanthiol，MFT)、二甲基二硫(dimethyl disulfide，DMDS)、二甲基三硫(dimethyl trisulfide，DMTS)等[7-8]，咖啡中含有糠(基)硫醇(2-furfurylthiol，FFT)[9]，葡萄酒中含有4-巯基-4-甲基-2-戊酮(4-mercapto-4-methyl-2-pentanon，4MMP)、3-巯基己基乙酸酯(3-mercaptohexyl acetate，3MHA)等[10]。食品中VSCs阈值较低，并呈现不同的香气特征，如：香草香、水果香、大蒜香、洋葱香、硫磺以及臭鸡蛋气息；由于化学性质活泼、浓度低等特点，导致VSCs的分析检测困难。研究发现VSCs即使在低浓度下也可以使食品产生特征风味或异味，影响食品质量和消费者可接受度。因此，全面认识、深入了解食品中硫化物结构、性质、生成路径、提取方法和分析检测技术及其感官特性，对食品风味的发展具有重要的意义。

1 结构与性质

目前，世界上已发现超过700多种含硫化合物，其中，食品中的VSCs主要包括：噻吩类化合物(约100种)、噻唑类化合物(约100种)、硫醇类化合物(约60种)、二硫醚类化合物(约100种)等[11](图1)。

图1 食品中VSCs的主要类型结构图Fig.1 The main structure of VSCs in foods

食品中最常见的硫化物是DMDS，约在110种食品中出现；其他的硫化物也常出现在食品中，如二甲基硫醚(dimethyl sulfide，DMS)(约 90种)，苯并噻唑(约80种)，DMTS(约60种)，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)(约50种)，噻唑(约30种)，乙酰基噻唑(约30种)，2-甲基噻吩(约30种)。与硫醇类化合物相比，噻唑、噻吩、硫醚、二硫醚类化合物化学性质稳定，易于提取；而硫醇化合物的硫原子具有强极性，其酸性(PKa: 9～12)也强于相应的醇类(PKa: 15)；性质活泼，易氧化、易聚合、易与醛酮类反应等[10～12]。MUELLER等[13]发现在氧气存在下，FFT易与羟基氢醌反应生成4-[2-呋喃甲基磺酰]羟基氢醌(4-[(2-furylmethyl)sulfanyl]hydroxyhydroquinone)和3,4-双[2-呋喃甲基磺酰]羟基氢醌(3,4-Bis[(2-furylmethyl)sulfanyl]hydroxyhydroquinone)，继而形成聚合物，导致失去咖啡风味。DREHER等[14]通过35 ℃贮藏橙汁8周，发现硫胺素发生降解，产生MFT，进而聚合生成双(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚(bis(2-methyl-3-furanthiol)，MFT-MFT)，产生烤肉气息，影响柑橘果汁风味。MURAT等[15]发现，白葡萄酒中的蛋氨酸易与乙二醛发生反应，生成3-甲硫基丙醛，继而降解为甲硫醇(methanethiol，MTL)、DMDS，产生煮熟的白菜和洋葱气息。

2 主要生成路径

2.1 源于植物或微生物的次级代谢

目前，β-裂解酶已在多种微生物体内和植物中发现，可以使半胱氨酸前驱物转化为风味物质。4MMP，3MH，3-巯基-3-甲基-1-丁醇都是葡萄酒中的特色风味物质，是葡萄在发酵过程中，由半胱氨酸前驱物S-4-(4-甲基-2-戊酮)-L-半胱氨酸，S-3-(1-己醇)-L-半胱氨酸，S-4-(4-甲基-2-戊酮)-L-半胱氨酸亚砜，通过酵母中β裂解酶作用产生[10]。白菜在贮藏过程中，异味物质DMDS、DMTS、MTL含量会升高，这与半胱氨酸亚砜裂解酶作用有关[16]。蒜氨酸(S-allyl-L-(+)-cysteine sulfoxide，SACS)是大蒜所含有的非蛋白类的含硫氨基酸，同时也是一种生物活性物质。大蒜体内的蒜氨酸在蒜酶作用下可以转化为大蒜素，此外，这种酶也可以将S-甲基-半胱氨酸亚砜、S-(E)-1-烯丙基-半胱氨酸亚砜和γ-谷酰(烯)基半胱氨酸转化为相应的烷(烯)基硫代亚磺酸酯，这些硫代亚磺酸酯类物质性质活泼，不稳定，容易降解或发生重排形成多种挥发性硫化物，包括：硫醇、硫醚、二硫醚类化合物等[17]。

2.2 光照导致VSCs的产生

光化学反应主要是指物质吸收紫外(190～400 nm)或可见光(400～760 nm)，使电子处于激发态而发生的反应。食品中许多硫醇化合物都来自光降解反应，影响食品风味。GRANT-PREECE等[18]发现对光敏感的核黄素会促进蛋氨酸的降解，产生日光臭。MAUJEAN等[19]通过采用模拟太阳光照的灯对装有香槟的玻璃瓶进行照射，发现在瓶中有H2S，MTL，DMDS物质生成。光照会引起啤酒中产生臭鼬气息，主要是因为3-甲基-2-丁烯-1-硫醇物质产生引起的，因此，啤酒常放置于可以避光的瓶中保存。

2.3 热反应导致VSCs的产生

半胱氨酸是许多挥发性硫化物的前体物质，在食品加工过程中，半胱氨酸与还原糖发生美拉德反应，产生FFT、2-巯基-3-戊酮、MFT，这一现象已经通过碳水化合物和半胱氨酸混合模拟试验证实[20-21]。主要反应机理是，碳水化合物降解为二羰基化合物，与半胱氨酸发生反应，生成一系列挥发性硫化物，影响食品风味[22]。此外，蛋氨酸经过Strecker降解反应生成3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛易发生降解，生成MTL，再次被氧化成DMDS[23]。如葡萄酒中的二羰基化合物(乙二醛、丙酮醛、丁二酮、2,3-戊二酮)，可以与蛋氨酸反应，产生3-甲硫基丙醛、MTL和DMDS；同时也可以与半胱氨酸反应，产生噻唑、4-甲基噻唑、2-乙酰基噻唑、2-噻吩硫醇、2-呋喃甲硫醇等[23-24]。

硫胺素(又名VB1)在110～130 ℃下加热1～6 h，易热分解为具有烧烤、肉味的硫化物。pH、温度和热处理时间等因素影响硫胺素的降解路径，最终导致不同产物的生成[25]；其中，硫胺素最主要的热降解产物是2-甲基-3-巯基呋喃(MFT)，并易发生氧化，形成MFT-MFT，产生烤肉香气[14]。除硫胺素的降解外，半胱氨酸和糖的美拉德反应或半胱氨酸与菊苣酮反应也可产生MFT[26]。据文献报道，MFT和MFT-MFT化合物都是肉类物质的特征风味化合物，且都具有较低的阈值(在水中，MFT:0.007 μg/L[27],MFT-MFT: 8.9×10-11mmol/L[28])。除肉制品以外，在橙汁中也发现了MFT和MFT-MFT，导致橙汁异味的产生[29]。DREHER等[14]通过模拟硫胺素在橙汁贮藏过程中的变化发现，除了MFT和MFT-MFT外，H2S和DMS也是重要的降解产物。

2.4 形成VSCs的其他途径

氧可导致VSCs的生成，如牛奶中蛋氨酸易被单线态氧氧化为DMDS，导致牛奶异味的产生[30]。此外，FFT是咖啡的特征风味物质，氧气促进了FFT和酚类物质的反应，形成醌类多聚体，导致其失去咖啡风味[9]。

醇的亲核取代导致VSCs的生成，如炒咖啡豆时，咖啡豆中的3-甲基-2-丁烯醇与H2S发生取代反应，生成3-甲基-2-丁烯-1-硫醇[31]。

γ辐照导致VSCs的生成，如辐照过的橙汁会产生异味，这主要与γ辐照导致橙汁中DMS，DMDS生成有关[32]。

3 样品处理和分析检测技术

含硫化合物种类繁多、含量较低。由于食品中复杂的基质(如碳水化合物、脂类、蛋白质等)的影响，对VSCs的提取、浓缩和检测造成了一定的影响，含硫化合物具有多样性的结构，从极性的硫氰酸酯和硫醇化合物到中等极性的呋喃硫醇类化合物和噻唑类化合物，结构差异导致硫化物的挥发性和溶解性具有较大的差异。此外，含硫化合物化学性质活泼，易氧化、易二聚化、并易受到温度、酶等因素的影响，因此，VSCs的分析手段应该具有高灵敏性、高选择性，不会导致副产物的产生和成本适中等要求。

3.1 样品处理技术

目前，从食品的复杂基质中提取、浓缩VSCs技术主要包括：蒸馏(distillation)、液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)、固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)和动态顶空-吹扫和捕集(dynamic headspace-purge and trap,HS-PT)等。

蒸馏技术是一种最常用的从食品中分离挥发性化合物的方法。具体包括普通蒸馏法、真空蒸馏法和同时蒸馏萃取法。蒸馏技术也被常用来提取VSCs，WERKHOFF等[4]采用真空蒸馏法提取西番莲中挥发性化合物，采用气-质联用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)检测，红外和核磁共振进行定性分析，共检测到47种硫化物，其中35种首次在西番莲中发现。

LLE也常用于样品的萃取。因硫化物结构的多样性、物化性质差异较大，导致LLE对硫化物的萃取效率不一致(10%～95%)，易引起定量不准。在LLE基础上，一般可以采用多种手段进行优化：如加入多个与萃取物性质相似的内标或稳定同位素标记的物质、延长萃取时间或采用多种溶剂进行萃取，都可以降低LLE萃取效率的不均匀性所带来的定量不准确性。

SPME是一种集采样、萃取、浓缩、进样技术为一体，具有萃取速度较快、无溶剂使用、价格相对低廉且安全的特点，广泛应用于样品顶空挥发物质的直接萃取。通常，萃取头的类型，平衡/萃取的温度或时间，顶空/样品的体积，搅拌子的速度，顶空中的气体成分(氮气或空气)，无机盐离子浓度等参数都会影响SPME的萃取效率。HELEN等[33]采用SPME(85μm CAR/PDMS纤维头)萃取切达奶酪中的硫化物，优化萃取条件，并结合GC-PFPD进行分离和检测，发现H2S、MTL、二甲亚砜、二甲基砜、DMS、DMDS、DMTS共 7种硫化物。SPME还被用来测定黑松茸中1-甲硫基丙烷、1-甲硫基丙烯[34]，以及啤酒中4MMP，3MH，3MHA[10]。SPME的高温解析，会导致副产物的产生，同时，纤维头上的碳分子筛含有0.9 mg/g的铁元素，铁化合物可作为氧化和脱氢的催化剂，会促进副产物的产生。在SPME分析过程中，硫醇化合物能够部分被氧化为二硫化合物，DMS被氧化为DMSO[35]。有研究表明[36]，采用顶空吹扫，将氮气代替顶空瓶中的空气，可以降低VSCs的氧化和1-对(孟)烯-8-硫醇、(±)-2,8-环硫-顺式-对孟烷化合物的环化。

HS-PT主要采用氦气作为吹扫气，将其通入样品溶液中持续吹扫，样品中挥发组分逸出，并通过捕集装置进行浓缩。通常，升高吹扫温度可以提高挥发性物质的逸出量，增强检测信号值。然而，SPANIER等[37]研究发现，在吹扫期间，提高温度会导致烹饪的牛肉中原有的物质发生分解产生副产物，影响分析结果。活性炭作为一种捕集材料，可以高效地捕集硫化物，却不易完全解析，导致回收率降低，影响硫化物的定量分析。因此，根据捕集材质和硫化物的类型，确定最大解析度和最小副产物生成的温度至关重要。此外，可以采用硅烷化的毛细管低温捕集器(冷阱)，利用液氮对挥发物质进行捕集冷凝，然后迅速升温使冷凝物再次挥发，减少了副产物产生，缺点是毛细管低温捕集器捕集能力有限。

3.2 分离检测技术

气相色谱通常以惰性气体为流动相，利用样品中的组分在色谱柱中分配系数不同而逐步实现组分分离的技术。通常与检测器联用，对硫化物进行分析检测。常用检测器包括：MS检测器、火焰光度检测器(flame photometric detector,FPD)、硫化学发光检测器(sulfur chemiluminescence detector,SCD)、脉冲式火焰光度检测器(pulsed flame photometry detector,PFPD)、原子发射光谱检测器(atomic emission detector,AED)。

FPD是一种针对食品中低浓度硫化物，具有高选择性和高灵敏性的检测器。氢气和空气燃烧提供能量，激发硫化物使其以S2·的形式发射出波长为394 nm的特征光，因发射光是由双分子硫引起的，所以激发光谱应与硫化物浓度的平方成正比。SUMITANI等[38]采用GC-FPD技术对温州蜜桔果汁的风味进行测定，证实了DMS的前驱物是S-甲基甲硫氨基酸(S-methylmethionine sulfonium,MMS)，同时得出计算MMS的方法：Y(1/1.7)=0.036 36X+0.004 85，Y是DMS和内标物甲基乙基硫醚(methyl ethyl sulfide，MES))的峰面积比值，X为MMS浓度(μmol/L)。

SCD是将硫化物的化学反应和光反应相结合测定硫、氮化合物，不受基质中碳氢化合物的影响，具有较高的选择性、灵敏性，对硫化合物等摩尔线性响应等特点。ALLEGRONE等[39]研究4种不同品种的柠檬果汁中挥发性成分的差异，采用SPME进行顶空萃取，结合GC/MS和GC-SCD/FID进行分离检测，研究发现挥发性成分在这4种柠檬中多少的顺序是Verdello Siracusano柠檬(50.28 mg/L)>Interdonato柠檬(8.39 mg/L)>Primo Fiore Capo d’Orlando柠檬(5.75 mg/L)>Femminello Siracusano柠檬(2.62 mg/L)，同时，发现柠檬果汁中含有6.5～10.1 μg/L的DMS。

PFPD是在FPD基础上开发的硫、磷选择性检测器，与FPD测定硫化物相比较，检测限(10×10-9)降低、选择性增大、可靠性增强、操作成本更加经济。PFPD脉冲火焰燃烧频率3～4次/秒，碳氢化合物火焰燃烧释放时间短暂0～2 ms，而S/P化合物燃烧释放时间长达3～25 ms，利用时间差设置门路，提高了检测元素的选择性。MAHATTANATAWEE等[40]分别采用GC-O、GC-MS和GC-PFPD对3种蒸煮香米的风味物质和挥发性硫化物进行比较，在Jasmine、Basnati、Jasmati香米中分别发现26、23、22种风味化合物，其中都包括DMS、3-甲基-2-丁烯-1-硫醇、MFT、DMTS、3-甲硫基丙醛5种硫化物，对香米的风味产生重要的影响。

AED是近年来发展起来的多元素检测器，主要是利用等离子体作为激发光源，激发被测组分，对其发射出的原子光谱进行测定，具有优越的检测限、多元素同时测定的能力、最大线性响应值等优点，然而，等离子激发源和多波长检测器的使用使AED成为最为昂贵的GC检测器之一，常常运用在环境检测上。

4 感官特征

特征风味化合物(characteristic flavor compounds，CFCs)是一类能够代表食品自身独特风味的化合物，有的在食品中浓度较低。其中，大部分VSCs不仅是公认的CFCs，也是引起食品异味产生的主要化合物，具有低含量和较低阈值的特点。

4.1 VSCs对风味的影响

通常，不同结构的硫化物将呈现不同的风味特征。此外，食品中某些硫化物存在手性异构体，它们的对映体风味通常各不相同。(R)-(+)-乙酸-3-巯基己酯化合物具有热带水果的风味，而其对映体(S型)却具有独特硫磺气息和香草气息，R型1-对孟烯-8-硫醇具有葡萄柚水果风味，而非对映体基本没有气味[41]。WEBER等[42]研究发现西番莲水果中96%的乙酸-3-巯基己酯是S型。此外，VSCs在基质中的不同浓度将展现出不同的风味，在适宜的低浓度时一般呈现某种特征风味，但浓度过高就会产生硫磺味或令人反感的异味。如DMS在水中的阈值为 30 μg/L，但浓度范围在30 ～100 μg/L的DMS，给予了lager啤酒独特的口感和风味；当DMS浓度高于100 μg/L时，会产生一种蒸煮的甜玉米香或类似黑加仑的味道[43]。

4.2 感官特性

通常，采用香气特性、阈值、香气活性值(odor activity value，OAV) 反映风味物质的对样品整体香气的贡献[11]。

食品中的挥发性化合物一般具有香气特性，如蒸煮气息、果香、油脂香、白菜香、洋葱气息等。食品中风味特性的确定可以采用培训感官小组成员对食品直接进行感官分析的方法，其中，评价员培训要遵循GB/T15549—1995和GB/T16291.1—2010。如PEREZ-CACHO等[44]培训12位评价员(6男6女，年龄25～60岁)，针对罐装和鲜榨不同处理的橙汁，分别对果汁中的橘香、花香、甜味、酸味、苦味等风味强度进行评分(1～5)，从而确定橙汁的风味特性。

风味物质也可以通过GC-O技术进行检测和评判，方法包括：阈值稀释法(Charm分析、芳香萃取物稀释分析(aroma extract dilution analysis，AEDA))、直接强度法(时间强度法、峰后强度法)、频率检测法。其中AEDA法最为常用。针对食品中微量的硫化物含量，GC-O可以识别低阈值风味物质，为硫化物的识别和鉴定提供参考作用。由于硫化物的化学性质不稳定等因素，导致定量具有一定的困难性。稳定同位素稀释法(stable isotope dilution assay,SIDA)是一种将稳定同位素标记的物质作为内标，可以有效的用于食品中硫化物的定量。将稳定同位素标记的物质作为内标，可以准确地定量榴莲果肉中H2S(3 340 μg/kg)、MTL(26 700 μg/kg)、乙硫醇(45 400 μg/kg)和丙硫醇(3 079 μg/kg)[45]。

香气阈值是指某种风味成分在特定介质中，使人体可以感受最低浓度。一般可以通过将风味物质溶解在溶剂中，如空气、水、乙醇溶液、淀粉、乳液或除味的食品中，采用鼻前通路(orthonasal olfaction)和鼻后通路(retronasal olfaction)对风味成分进行测定。其中，食品中的硫化物阈值较低，对食品风味产生重要影响。

1963年由ROTHE和THOMAS定义了OAV，是香气物质的浓度和阈值的比值[46]。OAV值一般反映物质对香气的的贡献值，通常OAV越大，对食品香气的整体贡献度就越大。GOMEZ-MIGUEZ等[47]在白酒中共发现5种硫化物，其中，MFT、FFT的OAV值分别为<0.1，4MMP、3MH、3MHA的OAV值分别为6.25、1.634、5.71。

5 结论

目前VSCs已在蔬菜、水果、海鲜、肉制品、葡萄酒、奶酪、奶粉、咖啡、薯条等食品中发现，对食品所具有的特征风味或令人厌恶的异味均具有重要的作用。深入了解VSCs与食品风味之间的关系，就必须运用VSCs自身所具有的化学性质、主要生成路径、样品处理技术、分析检测技术、感官特性等技术，鉴定硫化物的种类，定量硫化物的含量，确定VSCs的结构与风味之间的关系，为VSCs在食品的风味特性、异味研究及深度开发利用方面提供参考。