桑椹糖酸积累及相关酶活代谢特征研究

李 勇 邓 文 于 翠 莫荣利 朱志贤 胡兴明 庄楚雄

(1湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北武汉 430064； 2华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642)

果桑(Morusspp.)是多年生落叶果树，乔木或灌木，为桑科桑属植物中家桑的大果变种群[1]。果桑的果实(桑椹，又称桑果)为复果或多花果，果肉柔嫩多汁，营养丰富，风味独特，是加工食品、保健品和药品的良好原料，已被卫生部列入“既是食品又是药品”的名单[2]。目前全国果桑种植面积近5.33万hm2，桑椹产量达79万t，果桑产业发展迅速[3]。随着人民生活水平的提高，对水果品质的要求也不断提高，而糖酸含量及糖酸比是衡量果实品质的重要指标。糖既是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，它为植物的生长发育提供碳骨架和能量，并能增强植物的抗逆性[4]。水果中糖的种类、含量直接影响着果实的营养价值、风味口感、色泽等品质性状，其组成成份及其含量是决定果实风味的关键[5]。近年来，大量的研究表明，在生理、分子和信号转导水平上光合同化物的运输与代谢对果实的糖积累发挥着越来越重要的作用[6]。果实的有机酸与糖一起形成糖酸比，决定果实的风味，同时，果实的有机酸作为呼吸底物为合成其他物质提供基础，糖酸比是影响果实口感的最主要因子[7]。优化果实糖酸比、提升品质是提高其生产效益和经济效益的关键因素。针对桑椹品质的研究，尤其是糖和酸的积累、转运和代谢机制的研究落后于其他大宗水果，影响了果桑产业的发展。

为此，我们选择桑椹甜度差异较大的大10(DS)和白玉王(BY)2个果桑品种，分别于青果期、色变期、红果期、初熟期和成熟期取样，测定不同发育时期2个果桑品种桑椹的可溶性糖(TSS)、果糖(Fru)、葡萄糖(Glc)、蔗糖(Can)、乳糖(Lac)、麦芽糖(Mal)及可滴定酸(Tia)、柠檬酸(Cia)、苹果酸(Maa)、草酸(Oxa)、乙酸(Aca)、琥珀酸(Sua)的含量变化特征和蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)、可溶性酸性转化酶(soluble acid invertase，S-AI)和中性转化酶(neutral invertase，NI)活性的变化动态，研究桑椹的糖酸代谢及相关酶活性变化规律，旨在为调控桑椹发育与品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试桑椹 试验所用桑椹为紫黑果色DS和白果色BY的桑椹。果实样品均采自湖北省桑树种质资源圃内2011年栽植,树势和挂果量相近的嫁接树。

1.1.2 主要仪器 岛津LC-2010AHT液相色谱(HPLC)仪、RID-10A示差检测器、SPD-10AVP紫外可见检测器、LC-2010AHT二元梯度泵、CTO-10ASP恒温箱，均为日本Shimadzu公司产品；Shodex NH2P-50 4E(4.6×250 mm)色谱柱、NH2P-50G 4A保护柱，均为日本Shodex Asahipak公司产品；Aglient C18(4.6 mm×250 mm)色谱柱、Aglient C18 保护柱，均为美国Aglient公司产品。

1.1.3 主要试剂 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准品，苹果酸、草酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸和酒石酸标准品，均为色谱纯，Sigma公司产品；70%乙腈，上海安谱实验科技股份有限公司产品；乙酸锌，分析纯，上海国药试剂集团产品；亚铁氰化钾，分析纯，上海琳帝化工有限公司产品；蔗糖磷酸合成酶试剂盒、蔗糖合成酶试剂盒、中性转化酶试剂盒、可溶性酸性转化酶试剂盒，均为Solarbio公司产品；磷酸二氢钾，分析纯，东莞市斯巴达化学有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 采样时期及处理方法 DS和BY每个品种各随机选9株桑树，每3株作为1个重复，分别在青果期、色变期、红果期、初熟期和成熟期(图1-2)采样，每次采样重复3次。样品采集后当日置于加冰的保鲜箱中，运回实验室进行酶活性分析，其余样品经液氮处理保存于-70 ℃冰箱内用于糖酸含量测定分析。

从左向右依次为青果期、色变期、红果期、初熟期和成熟期，图2相同。图1 果桑大10(DS)不同发育时期的桑椹

1.2.2 溶液的配制 (1)21.9%乙酸锌溶液的配制。称取21.9 g乙酸锌，加3 mL冰乙酸，加超纯水溶解并稀释至100 mL，配制成21.9%的乙酸锌溶液。(2)10.6%亚铁氰化钾溶液的配制。称取10.6 g亚铁氰化钾，加超纯水溶解并稀释至100 mL，配制成10.6%的亚铁氰化钾溶液。(3)0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液的配制。称取13.6 mg的磷酸二氢钾，溶入1 000 mL双蒸水中，用磷酸调pH值至2.6，配制成0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液。

1.2.3 不同糖含量的测定 分别称取经过96 ℃±2 ℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准品各1 g，加超纯水于50 mL的容量瓶中定容至50 mL刻度。然后，分别移取上述标准品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16.0 mL于50 mL容量瓶中并加超纯水定容至50 mL刻度，用岛津LC-2010AHT液相色谱仪进行测定，色谱条件为检测器温度40 ℃，进样量20 μL，色谱柱柱温40 ℃，流动相70%乙腈，流速1 mL/min，建立标准曲线并得出相关系数。

将DS和BY不同时期的桑椹样品打碎混匀，分别称取样品 2 g于100 mL容量瓶中，加超纯水约50 mL溶解，缓慢加入21.9%乙酸锌溶液和10.6%亚铁氰化钾溶液各5 mL，然后加超纯水定容至100 mL刻度，超声波处理30 min，用干燥滤纸过滤，初滤液重复浸提2次，合并滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至样品瓶，用岛津LC-2010AHT液相色谱仪测定DS和BY不同时期桑椹的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖含量，色谱条件为检测器温度40 ℃，进样量20 μL，色谱柱柱温40 ℃，流动相70%乙腈，流速1 mL/min，根据样品峰面积和各种碳水化合物的标准曲线计算其含量。蒽酮硫酸比色法测定果实可溶性总糖含量[8]。

1.2.4 不同有机酸含量的测定 分别称取经过96 ℃±2 ℃干燥2 h的苹果酸、草酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸标准品各1 g，加流动相(0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液)于50 mL的容量瓶中定容至50 mL刻度。然后，分别移取上述标准品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16.0 mL于50 mL容量瓶中并加流动相(0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液)定容至50 mL刻度，用岛津LC-2010AHT液相色谱仪进行测定，色谱条件为检测器温度30 ℃，进样量10 μL，色谱柱柱温30 ℃，流动相0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 2.55)，流速0.5 mL/min，检测波长 210 nm，建立标准曲线并得出相关系数。

将DS和BY不同时期的桑椹样品打碎混匀，分别称取样品2 g于100 mL容量瓶中，加入流动相5 mL，加超纯水定容至100 mL刻度，然后超声波处理30 min，60 ℃水浴加热1 h。用干燥滤纸过滤，初滤液重复浸提2次，合并滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤至样品瓶，用岛津LC-2010AHT液相色谱仪测定DS和BY不同时期桑椹的苹果酸、草酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸含量，色谱条件为检测器温度30 ℃，进样量10 μL，色谱柱柱温30 ℃，流动相0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 2.55)，流速0.5 mL/min，检测波长210 nm，根据样品峰面积和各种碳水化合物的标准曲线计算其含量。用氢氧化钠滴定法测定果实可滴定总酸含量[9]。

1.2.5 糖代谢相关酶活性的检测 采用Solarbio公司生产的蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、中性转化酶、可溶性酸性转化酶试剂盒测试SPS、SS、NI、S-AI酶活性。

A.可溶性糖，B.果糖，C.葡萄糖，D.蔗糖，E.乳糖，F.麦芽糖。DS代表果桑大10的鲜桑椹，BY代表果桑白玉王的鲜桑椹；图4-5相同。图3 DS和BY桑椹发育过程的糖含量变化

1.2.7 数据处理与分析 所有数据均取5次以上重复测定的平均值，通过Microsoft Office Excel 2007进行整理，其它统计分析均采用SPSS 19.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同发育时期桑椹糖的积累

A.可滴定酸，B.柠檬酸，C.苹果酸，D.草酸，E.乙酸，F.琥珀酸。图4 DS和BY桑椹发育过程的可溶性酸含量变化

试验结果显示，2个品种的桑椹不同发育时期的糖分含量存在差异，但可溶性糖含量从红果期开始均呈直线上升的趋势，初熟期至成熟期均有不同程度的下降(图3-A)。糖分含量中果糖和葡萄糖的含量高于其他糖分的含量，糖分积累均以果糖和葡萄糖为主，但2个果桑品种的桑椹在成熟期蔗糖的含量均上升至较高水平，推测桑椹为蔗糖和己糖(果糖和葡萄糖)共同积累型果实。由红果期至成熟期，2个果桑品种桑椹的果糖和葡萄糖含量均呈快速升高的趋势，在桑椹成熟期，2个果桑品种桑椹的果糖和葡萄糖含量达到最高，DS鲜桑椹的果糖和葡萄糖含量分别为31.970 mg/g 和34.013 mg/g，BY鲜桑椹的果糖和葡萄糖含量分别为34.790 mg/g和36.064 mg/g，整个发育过程中，BY各个时期鲜桑椹的果糖和葡萄糖含量始终高于DS各个时期的鲜桑椹，除初熟期外，其他4个时期差异均达显著水平(图3-B和图3-C)。2个果桑品种各个时期鲜桑椹的蔗糖含量变化各异，DS鲜桑椹呈现出“升降升”的趋势，而BY鲜桑椹呈现出“倒抛物线”的变化特征(图3-D)，其中DS各个时期鲜桑椹的蔗糖含量在色变期最高为0.244 mg/g，BY各个时期鲜桑椹的蔗糖含量在青果期最高为0.182 mg/g。2个果桑品种鲜桑椹的乳糖在整个发育过程中均呈逐渐降低的趋势(图3-E)，DS和BY鲜桑椹青果期的乳糖含量分别为1.166 mg/g和1.267 mg/g。随着桑椹果实的发育，2个果桑品种鲜桑椹的麦芽糖含量呈逐渐升高的趋势(图3-F)，在桑椹成熟期，2个果桑品种鲜桑椹的麦芽糖含量达到最高，BY鲜桑椹为7.660 mg/g，显著大于DS鲜桑椹的2.896 mg/g。

2.2 不同发育时期桑椹有机酸的积累

随着果实的生长发育，不同有机酸组分的含量也会发生变化，但当果实生长进入成熟阶段时，大部分有机酸组分含量逐渐下降(图4)。2个果桑品种鲜桑椹的可滴定酸变化各异，DS鲜桑椹呈先升后降的趋势，而BY在桑椹发育过程中呈逐渐下降的趋势(图4-A)。在桑椹发育过程中，BY鲜桑椹的柠檬酸、苹果酸、草酸和乙酸均呈先升高后降低的趋势，在初熟期，4种有机酸的含量均升至最高，分别为0.268 mg/g、1.072 mg/g、0.101 mg/g和1.458 mg/g，而后在成熟期降至最低。DS鲜桑椹中柠檬酸、草酸和乙酸含量变化趋势与上述BY鲜桑椹中4种有机酸含量的变化趋势类似，即呈先升后降的趋势，但柠檬酸和草酸含量最高值出现在红果期，分别为7.384 mg/g和0.031 mg/g，乙酸含量最高值出现在初熟期为0.689 mg/g；其苹果酸含量整体呈逐渐下降的趋势。在整个发育过程中，2个果桑品种鲜桑椹的琥珀酸含量变化趋势类似，均呈先降后升的趋势，其中DS鲜桑椹的琥珀酸含量在色变期降至最小值为0.004 mg/g，BY鲜桑椹的琥珀酸含量在红果期降至最小值为0.096 mg/g。

A.SS活性，B.SPS活性，C.S-AI活性，D.NI活性。图5 DS和BY桑椹发育过程糖代谢相关酶活性变化情况

2.3 不同发育时期桑椹蔗糖代谢相关酶的活性

随着桑椹的生长发育，DS和BY鲜桑椹的SS活性呈现出先升后降的变化趋势，其活性从青果期到红果期逐渐升高，于红果期出现峰值，DS为4 583.33 U/(g·min)、BY为6 705.88 U/(g·min),且DS鲜桑椹的SS活性显著小于BY鲜桑椹(P<0.05)，从红果期到成熟期又逐渐降低(图5-A)；2个果桑品种鲜桑椹的SPS活性，DS鲜桑椹发育过程中基本维持恒定水平，而BY鲜桑椹的SPS活性在色变期升至峰值达1 048.78 U/(g·min)，DS和BY鲜桑椹的SPS活性差异不显著(图5-B)。可见，鲜桑椹的SPS和SS活性随发育过程的变化在不同品种间各异。DS和BY鲜桑椹的S-AI活性在色变期至初熟期均呈现出逐渐升高的趋势，但DS鲜桑椹初熟期至成熟期呈下降的趋势，而BY鲜桑椹则继续呈升高的趋势，且青果期至初熟期DS鲜桑椹的S-AI活性始终显著大于BY鲜桑椹(P<0.05)，DS鲜桑椹的S-AI活性在初熟期达到峰值为1 736.80 U/(g·min)，BY鲜桑椹的S-AI活性在成熟期达到峰值为1 435.20 U/(g·min)(图5-C)；DS鲜桑椹的NI活性在青果期至红果期呈上升的趋势，红果期后呈先降后升的趋势，而BY鲜桑椹的NI活性在色变期至成熟期呈缓慢升高的趋势，DS鲜桑椹的NI活性在红果期达到峰值为361.92 U/(g·min)，而BY鲜桑椹的NI活性在成熟期达到峰值为147.68 U/(g·min)，DS鲜桑椹的NI活性峰值显著大于BY鲜桑椹的NI活性峰值(P<0.05)(图5-D)。可见，不同品种鲜桑椹的NI活性变化在果实发育后期较前期更为活跃，这与S-AI活性表现相一致。可以推测在桑椹发育的后期转化酶可能参与多条代谢途径调控果实生长发育，从而表现出较高的酶活性。

2.4 不同发育时期桑椹糖积累与蔗糖代谢相关酶活性的相关性及主成分分析

从DS桑椹糖含量与其蔗糖代谢相关酶活性的相关性(表1)可以看出，DS桑椹的TSS与Can、Lac、SS、SPS呈负相关，与Fru、Glc显著正相关,与Mal极显著正相关；Fru与Lac、SPS呈负相关，与Glc、Mal极显著正相关；Glc与Lac、SPS呈负相关，与Mal极显著正相关；Can与Mal、SPS、S-AI呈负相关；Lac与SPS呈正相关；Mal与SS、SPS呈负相关；SS与SPS呈负相关，与NI显著正相关；SPS与S-AI呈负相关，与NI显著负相关；S-AI与NI呈正相关。从BY桑椹糖含量与其蔗糖代谢相关酶活性的相关性(表2)可以看出，BY桑椹的TSS与Can、Lac、SS呈负相关，与SPS显著负相关，与其他呈正相关；Fru与Lac、SS、SPS呈负相关，与Glc极显著正相关，与Mal、S-AI显著正相关；Glc与Lac、SS、SPS呈负相关，与Mal、S-AI显著正相关；Can与SS、S-AI、NI呈负相关，与Lac、Mal、SPS呈正相关；Lac与Mal、SS、S-AI、NI呈负相关，与SPS呈正相关；Mal与SS呈负相关，与SPS、S-AI、NI呈正相关；SS与SPS呈负相关，与S-AI、NI呈正相关；SPS与S-AI、NI呈负相关；S-AI与NI极显著正相关。以上相关性分析结果表明，桑椹发育过程中，其己糖含量逐渐升高的主要原因是运输到果实中的蔗糖被转化酶(S-AI和 NI)分解为果糖和葡萄糖。而DS桑椹中SS活性与蔗糖积累呈正相关，但BY桑椹中SPS活性与蔗糖积累呈正相关，SS存在于细胞质中，可以和尿苷二磷酸(UDP)催化蔗糖成为尿苷二磷酸葡萄糖(UPDG)和果糖，这是一个可逆反应，分别由蔗糖合成酶(合成方向)和蔗糖合成酶(分解方向)催化。

表1DS桑椹糖含量与其蔗糖代谢相关酶活性的相关性

TSSFruGlcCanLacMalSSSPSS-AINITSS1Fru0.921∗1Glc0.924∗0.999∗∗1Can-0.0790.0560.0101Lac-0.436-0.365-0.3810.0041Mal0.980∗∗0.978∗∗0.981∗∗-0.039-0.4401SS-0.0820.0160.0230.276-0.801-0.0051SPS-0.157-0.036-0.035-0.3280.864-0.118-0.8011S-AI0.8140.5960.620-0.431-0.6850.7400.118-0.4081NI0.1910.2170.2200.322-0.916∗0.2330.948∗-0.912∗0.3511

*表示在 0.05 水平(双侧)上显著相关，**表示在 0.01 水平(双侧)上极显著相关；表2相同。

表2BY桑椹糖含量与其蔗糖代谢相关酶活性的相关性

TSSFruGlcCanLacMalSSSPSS-AINITSS1Fru0.6461Glc0.6260.999∗∗1Can-0.4050.1030.1391Lac-0.694-0.677-0.6560.5611Mal0.2400.896∗0.906∗0.354-0.4771SS-0.044-0.204-0.221-0.606-0.520-0.2021SPS-0.887∗-0.317-0.3010.3410.4700.110-0.0441S-AI0.8320.921∗0.912∗-0.132-0.8370.6950.043-0.6101NI0.8260.8360.826-0.196-0.8710.5950.197-0.6720.981∗∗1

以DS和BY 2个果桑品种桑椹发育过程中5种糖分含量均值为原始变量，进行主成分分析，以成分得分系数矩阵回归分析得到线性组合模型，以每个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比率作为权重建立主成分综合模型，分别用公式5至公式8计算综合得分。

从图6可以看出，2个果桑品种鲜桑椹的PC1、PC2这2个主成分的累积方差贡献率分别为DS 83.84%和BY 96.74%，表明2个主成分可以代表桑椹糖分品质风味性状。主成分载荷系数的绝对值越大，主成分对该变量的代表性越大。在DS鲜桑椹的PC1中(图6-A)，葡萄糖和麦芽糖的载荷系数比较大，分别是0.983和0.988，它们共同构成 PC1方差变异的主要因素，反映DS鲜桑椹中决定风味好坏和浓淡的糖分含量的变异。而在DS鲜桑椹的PC2中，构成其方差变异的主要因素是蔗糖，它的载荷系数是0.998，反映DS鲜桑椹中果糖含量的变异情况。在BY鲜桑椹的PC1中(图6-B)，葡萄糖和麦芽糖的载荷系数分别是0.989和0.955，而在BY鲜桑椹的PC2中，蔗糖的载荷系数是0.966。

A.DS鲜桑椹糖组分含量，B.BY鲜桑椹糖组分含量。图6 DS和BY桑椹糖分的主成分分析

3 小结与讨论

糖酸含量是衡量果实品质的主要依据之一[10]。本研究结果表明，2个果桑品种桑椹不同发育时期糖分含量存在差异，可溶性糖含量从红果期开始至初熟期呈直线上升的趋势，初熟期至成熟期有不同程度的下降。糖分含量中果糖和葡萄糖含量始终高于其他糖分，糖分积累均以果糖和葡萄糖为主，但2个果桑品种鲜桑椹在成熟期蔗糖含量均上升至较高水平，推测桑椹为蔗糖和己糖(果糖和葡萄糖)共同积累型果实。BY各个时期鲜桑椹的果糖和葡萄糖含量均高于DS各个时期的鲜桑椹。桑椹发育过程中，2个果桑品种鲜桑椹可滴定酸含量变化各异，但成熟期BY鲜桑椹的有机酸含量均略低于或与DS鲜桑椹相当，其主要原因可能是BY鲜桑椹的糖酸比高于DS鲜桑椹。果实中，苹果酸和柠檬酸均为三羧酸循环(TCA)的主要中间产物[11]，一般不应有大量积累，2个果桑品种桑椹发育过程中苹果酸和柠檬酸含量变化特征也印证了这一点。蔗糖代谢相关酶活性变化与植物组织中糖含量的多少密切相关[12-14]。

2个果桑品种鲜桑椹的SPS和SS活性随发育过程的变化在不同品种间各异。SPS活性变化与蔗糖积累趋势类似，但S-AI、NI活性整体呈上升的趋势。SPS是一种定位在细胞质中的可溶性酶，它能够可逆地催化UPDG和6-磷酸果糖生成6-磷酸蔗糖、UDP和H+[15]。推测DS鲜桑椹中SS合成方向的酶活性高于分解方向的酶活性，高S-AI和NI活性有利于桑椹己糖的积累，表明转化酶在桑椹糖积累过程中发挥着重要作用。而蔗糖转化酶(invertase)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一[16]。在桑椹发育过程中，推测正是由于S-AI、NI活性的不断升高，导致果桑的光合产物——蔗糖被不断分解为果糖和葡萄糖。在果实发育不同阶段，参与糖代谢的酶活性各异，其果实品质的形成可能为各种酶协同作用的结果[17-18]。不同果桑品种桑椹发育过程中糖含量与其蔗糖代谢相关酶活性之间相关性分析结果表明，DS鲜桑椹中SS活性与蔗糖积累正相关，但BY鲜桑椹中SPS活性与蔗糖积累正相关，SS存在于细胞质中，可以和尿苷二磷酸(UDP)催化蔗糖成为尿苷二磷酸葡萄糖(UPDG)和果糖，这是一个可逆反应，分别由蔗糖合成酶(合成方向)和蔗糖合成酶(分解方向)所催化。

桑椹糖分的主成分分析结果表明，决定不同品种桑椹糖风味的果糖和葡萄糖的含量和比率对桑椹糖风味形成具有重要的意义，但蔗糖和麦芽糖的含量和比率又可影响到果糖和葡萄糖的含量和比率。因桑椹糖风味除受遗传因素影响外，还受环境条件、栽培技术等的影响[19-20]，就DS和BY 2个果桑品种的桑椹而言，果糖和葡萄糖可以作为评价不同栽培措施对其桑椹糖风味的主要评价参数，其综合评价模型为F= 0.220×f+0.217×g+0.288×c+0.074×l+0.251×m(式中F代表综合得分，f、g、c、l、m分别代表桑椹中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖的原始变量)。但果桑品种众多，对于其他果桑品种的桑椹，还有待进一步探讨。果实的糖酸代谢是个极复杂的生理生化过程，受多种因素的调控与影响[21]。因此，桑椹糖酸代谢的内在机理与外界因子对其影响与调控都需要进一步研究。