慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化患者中HBV-DNA水平、HBV-M、淋巴细胞亚型特点分析*

赵海燕， 杨东， 洪伟， 邵花平

南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院(徐州医科大学附属宿迁医院)感染科(江苏宿迁 223800)

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，全球约20亿人曾感染HBV[1]，我国现有的慢性HBV感染者约9 300万人[2]。HBV感染可导致病毒性肝炎，易慢性化并逐渐发展为肝硬化甚至肝衰竭、肝癌。目前研究表明慢性乙型肝炎细胞损伤和炎症反应是由宿主免疫反应和病毒共同作用的结果，外周血淋巴细胞亚型数量及功能的改变可以反映机体的免疫状态。乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)是监测HBV感染的重要标志，而乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)则反映HBV有无复制及传染性的强弱。本实验主要通过分析HBV-M定量、HBV-DNA、淋巴细胞亚群在两组患者中分布特点，比较两组间差异，探讨在两组间的变化；同时分析HBsAg与HBV-DNA之间及HBsAg、HBV-DNA与淋巴细胞亚型之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2016年12月至2018年1月住院的慢性乙型肝炎患者45例及乙肝肝硬化患者35例为研究对象。慢性乙型肝炎组中男37例，女8例，年龄(32.11±10.54)岁。乙肝肝硬化组中男23例，女12例，年龄(50.00±11.99)岁。

1.2 方法

1.2.1 入组标准 (1)诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》的慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化临床诊断标准[3]。排除标准：(1)合并HAV、HCV、HDV、HGV等病毒性肝炎病毒感染；(2)其他原因(自身免疫性、药物性、酒精性、中毒性等)肝病导致的慢性肝损伤；(3)妊娠或哺乳期妇女；(4)合并肝癌。

1.2.2 检测 HBV-M定量由南京金域检验中心检验；外周血淋巴细胞检测：采集 EDTA 抗凝外周血，加入相应的 CD45、CD3、CD4、CD8、CD56、CD19荧光标记流式抗体，流式细胞术检测患者外周血T淋巴细胞及其亚群、B淋巴细胞、NK细胞；HBV-DNA定量检测采用ABI7300型自动荧光聚合酶链式反应(PCR)检测仪(美国AB Applied Biosystems公司生产)，试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，两组间比较采用非参数检验，两两间相关性分析采用Spearman相关性检验, 检验水准P=0.05。

2 结果

2.1 HBV-M定量及HBV-DNA两组患者间比较 乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(HBeAb)、HBV-DNA滴度在慢性乙型肝炎组、乙肝肝硬化两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝核心抗体(HBcAb)在两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 淋巴细胞及亚型两组间比较 乙肝肝硬化组的淋巴细胞总数、T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞绝对值较慢性乙型肝炎组下降，其中淋巴细胞总数、CD4+T淋巴细胞、CD8+T两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 慢性乙型肝炎与乙肝肝硬化HBV-M定量及HBV-DNA比较 M(P25,P75)

表2 慢性乙型肝炎组与乙肝肝硬化组淋巴细胞计数及亚型的比较 M(P25,P75)

2.3 慢性乙型肝炎组HBsAg、HBV-DNA与淋巴细胞及亚型之间的相关性分析 HBsAg与淋巴细胞总数及各淋巴细胞亚型之间均无相关性，HBV-DNA与淋巴细胞总数及各淋巴细胞亚型之间亦无相关性。见表3。

表3 慢 性乙型肝炎组HBsAg、HBV-DNA与淋巴细胞及亚型的相关性

2.4 乙肝肝硬化组HBsAg、HBV-DNA与淋巴细胞及亚型之间的相关性分析 HBsAg与淋巴细胞总数及各淋巴细胞亚型之间均无相关性，HBV-DNA与淋巴细胞总数及各淋巴细胞亚型之间亦无相关性。见表4。

表4 乙 肝肝硬化组HBsAg、HBV-DNA与淋巴细胞亚型的相关性分析

2.5 慢性HBV感染患者HBV-DNA与HBsAg、HBeAg相关性分析 慢性HBV感染患者中HBV-DNA载量与HBsAg、HBeAg均呈正相关(r=0.338、0.336，P=0.011、0.011)。

3 讨论

HBV感染呈世界性流行，我国是HBV感染的高发区，全球肝硬化患者中30%是由HBV感染引起，在我国更有多达 60%的肝硬化患者是由HBV感染引起[3]。因此对乙型肝炎的诊断、判断病情、分析疗效、评估转归是一个值得关注的问题。HBV感染是引起慢性肝病最常见的原因，病毒和机体两方面的因素决定感染后的临床转归。乙肝肝硬化是肝脏长期炎症反应和纤维化形成的结果，本实验主要研究HBV-M、HBV-DNA以及淋巴细胞亚型在慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化中的分布差异。

HBV感染中HBV-M是监测HBV感染的重要标志，HBsAg是HBV感染的重要标志，研究表明，HBsAg与肝内共价闭合环状DNA(cccDNA)之间具有良好相关性，定量检测HBsAg对预测抗病毒的治疗疗效有重要意义[4]， HBeAg 的转归则是治疗有效最明显的标志，而 HBV-DNA 则反映有无复制和传染性的强弱。本组研究结果显示HBsAg、HBeAg、HBV-DNA在乙肝肝硬化组较慢性乙型肝炎组明显降低，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明乙型肝炎进展为肝硬化过程中HBsAg、HBV-DNA逐渐下降, 这与裴彦祯等[5]及Wong等[6]的研究结果一致，主要因为由于HBV侵入机体后，机体产生特异性细胞和体液免疫应答，从而造成肝细胞损害。随着HBV感染时间的延长，累积的免疫损伤也相应加重，肝细胞破坏程度也越严重，造成的肝细胞坏死也越广泛，进而导致依赖于肝细胞的HBV复制减少，因此外周血HBV-DNA复制水平降低。同时，HBsAg和HBV复制一样，也是依赖于肝细胞产生，以cccDNA为模板合成并组装成完整的病毒颗粒后分泌至血液中，故肝细胞大量坏死也同样导致HBsAg的合成与分泌减少[7]。故乙肝肝硬化患者HBV-DNA、HBsAg较慢性乙型肝炎明显下降。慢性乙型肝炎进展至乙肝肝硬化患者经历免疫清除期，患者在免疫清除期出现血清学转换，HBeAg转阴，产生HBeAb，故乙肝肝硬化患者HBeAg较慢性乙型肝炎患者低，且两者差异有统计学意义(P<0.05)。

Wursthorn等[8]研究表明血清HBsAg的下降和肝内HBV-DNA的下降速度平行，两者呈正相关, 然而Wiegand等[9]认为HBsAg下降水平与HBV-DNA并不平行。本组研究表明HBsAg与HBV-DNA呈正相关，但相关系数不高(r=0.338)，可能由于两者都是依赖肝细胞产生，均以cccDNA为模板，组合成完整的Dane颗粒分泌至血液中有关。但HBsAg和HBV-DNA的合成和分泌路径不完全相同，Dane颗粒内含HBsAg、DNA、核心抗原(HBcAg)是病毒复制的主体，同时血液中还存在小球形颗粒，管型颗粒，后两种颗粒由HBsAg组成不含DNA，就造成两者的弱正相关性。外周血HBV-DNA载量是反映病毒感染和复制程度的重要指标[10-11]，对判断病毒复制程度，传染性大小，抗病毒药物疗效等有重要意义。HBsAg和HBV-DNA定量水平存在相关性，在一定程度上HBsAg可反映HBV-DNA的复制情况。因此，可将治疗前后的HBsAg水平变化作为疗效评价的指标之一，HBsAg 定量测定结合HBV-DNA定量结果可以更好地反映肝细胞内HBV的复制及疾病的进展情况，对于肝硬化严重程度的无创评估有重要意义。但在临床工作中监测判断抗病毒治疗是否有效时，单纯依赖 HBsAg和HBV-DNA定量水平的变化是不够的，肝脏影像学及病理学的检查仍是非常必要的。HBeAg 水平高低是反应病毒复制水平高低及传染性强弱的标志。本组研究表明HBeAg与HBV-DNA呈正相关，原因可能与两者均可以反映机体内病毒的复制水平相关。

乙型肝炎是一种免疫相关性疾病，机体感染HBV后并不直接对肝细胞造成损伤，而是通过诱导机体的免疫反应间接损伤肝细胞[12-13]。T淋巴细胞是人体主要的免疫细胞，其数量的变化在一定程度上反映了机体的免疫水平。正常机体内 T 淋巴细胞及各亚群在不同的组织中有着不一样的比例，而且相对稳定[14]。人体T细胞由不同的亚群组成，由各亚群的数量、比例来调节和维持人体免疫内环境稳定，T细胞亚群紊乱是导致人体不能清除HBV病毒、慢性化及重症化的主要原因[15]。同时，外周血T细胞亚群是反映HBV感染者免疫状态的重要指标[16]。有文献[17]表明HBV感染后在体内诱导T细胞凋亡, 导致T细胞数量减少及亚群比例异常, 并随病程进展逐渐加重, 从而引起HBV感染慢性化及不同程度的肝细胞损伤。本研究中乙肝肝硬化组的淋巴细胞总数、T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞绝对值较慢性乙型肝炎组下降，其中淋巴细胞总数、CD4+T淋巴细胞、CD8+T两组间差异有统计学意义(P<0.05)。表明乙肝肝硬化患者机体T淋巴细胞免疫较慢性乙型肝炎组下降，可能与乙肝肝硬化患者经历免疫清除期后大量淋巴细胞被消耗相关。CD4+T、CD8+T淋巴细胞分别代表两类主要T细胞。CD4+T淋巴细胞因为具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能，所以被称为辅助性T细胞，CD8+T淋巴细胞主要为细胞毒性T细胞，可以识别并杀伤HBV感染的细胞。本实验研究结果显示随着病情由慢性乙型肝炎至肝硬化进展，CD4+T淋巴细胞显著性降低，提示乙肝肝硬化患者CD4+T淋巴细胞受损严重，说明在慢性HBV感染的过程中，CD4+T淋巴细胞降低，使其辅助体液免疫细胞的功能不足，以致其产生抗体和细胞毒性杀伤作用的功能减低，这可能为HBV感染慢性化的重要原因。同时在慢性HBV感染者中，由于CD4+T淋巴细胞数量显下降，导致HBV特异性CD8+T淋巴细胞减少，使得HBV不能完全清除。CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量的减少，可能导致机体细胞免疫功能下降，感染乙肝病毒后不易清除，与疾病的慢性化有关，但是CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量减少并不能完全提示其功能上的降低[18]，因此仍需完善其功能方面的检验分析其与肝炎转归的关系。本组研究中T淋巴细胞总数及亚群水平与 HBV-DNA载量无相关性与李彩东等[19]研究结果一致，该研究认为：机体的免疫功能障碍主要表现为免疫细胞功能缺陷，而非数量不足，这也许说明了HBV 感染者T淋巴细胞数量的变化与HBV-DNA载量没有明显相关性的原因。

综上所述，本研究显示HBsAg、HBeAg与 HBV-DNA定量水平随着慢性乙型肝炎发展至肝炎肝硬化过程中逐渐下降，且在两种疾病状态中HBV-DNA载量与HBsAg、HBeAg均呈正相关，因此可将HBsAg、HBeAg与 HBV DNA结果相结合可更好地反映慢性乙肝的疾病进展情况，对评价抗病毒药物治疗的疗效和判断预后有重要意义。同时临床上可以通过检测外周血T淋巴细胞亚群可以对疾病的进展进行评估，有利于了解机体的免疫功能，从而为抗病毒治疗的指征、时机和疗效预测提供依据。这些发现为慢性乙型肝炎患者的诊断及治疗提供了良好的依据和思路。当然本研究仍有不足之处，所选样本量较小、未根据慢性乙肝疾病状态进行分组，及肝硬化Child评分进一步分组等，在接下来的进一步实验中将更加优化分组，更加全面详细地了解在疾病进展过程中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA、各组T淋巴细胞数量的变化，为临床诊疗工作提供新思路。