惠州地区β缺失型地贫的基因诊断及临床特征分析*

钟泽艳， 陈剑虹， 官志扬， 贺海林， 钟国兴， 杨坤祥

惠州市妇幼保健计划生育服务中心产前诊断中心(广东惠州 516007)

β地中海贫血(以下简称β地贫)是我国南方最常见的单基因遗传病之一，是一种由于珠蛋白基因表达缺陷导致的珠蛋白链合成减少或缺如的溶血性贫血疾病[1]。β珠蛋白基因簇位于11号常染色体的短臂，常见的β地贫主要是由于β珠蛋白基因簇的点突变引起，只有少数是因β珠蛋白基因簇的大片段缺失(称β缺失型地贫)。β缺失型地贫主要见于δβ地贫，其特征是由于基因发育表达失控引起的胎儿出生后血红蛋白F(hemoglobin,HbF)持续增高，且存在遗传异质性大[2-3]。研究报道，在我国最常见的β缺失型地贫主要有3种，分别为东南亚型HPFH(SEA-HPFH)、中国型Gγ(Aγδβ)0、中国台湾型(Taiwanese)[2-4]。在广东省的大样本地贫基因携带率的调查中发现，惠州地区的地贫基因携带率(17.50%)明显高于全省的平均水平(16.83%)[5]。因此，地贫防控的有效实施与完善对于提高惠州市人口的健康水平和质量具有重大意义。本研究利用广东省孕前和孕期优生健康检查信息管理平台，以惠州市政府“民生工程”为背景，分析惠州地区育龄夫妇人群中SEA-HPFH、中国型Gγ(Aγδβ)0和Taiwanese缺失地贫的基因携带率及临床特征等流行病学资料，完善惠州地区人群地贫防控模式，为本市的优生优育工作提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年10月至2017年11月，参加惠州市孕前和孕期优生健康检查的育龄夫妇，通过医院医学伦理委员会批准及知情同意的原则，符合免费政策要求在本院进行地贫基因分析的受检者39 170例。年龄(26±5.31)岁，近3个月无输血史，均来源于惠州市的六大县区(惠城区、惠东县、博罗县、龙门县、大亚湾和仲恺高新区)。

1.2 样本采集 在知情同意的原则下，抽取受检者外周血两管(2 mL/管)，一管使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，用于血常规检测。一管使用枸橼酸钠(ACD)抗凝，用于血红蛋白(hemoglobin，Hb)电泳分析和地贫基因分析。同时，本中心对可能会分娩中、重型地贫患儿的孕妇行产前诊断。

1.3 研究方法

1.3.1 血常规检测 采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司的BC-5380全自动五分类血液细胞分析仪检测红细胞参数，包括Hb、红细胞平均体积 (mean corpuscular volume，MCV)及红细胞平均血红蛋白含量 (mean corpuscular hemoglobin，MCH)等。采用厂家原装配套试剂，其中外院样本的血常规检测在当地区县的医院完成并将数据报送我院。

1.3.2 Hb电泳分析 采用法国Sebia公司的Capillarys 2 flex piercing全自动毛细管电泳仪分析Hb组分。分析内容主要包括血红蛋白A(hemoglobin A，HbA)、血红蛋白A2(hemoglobin A2，HbA2)和HbF等。当HbA2>3.50%和(或)HbF>2.50%，判定为β地贫表型阳性[5-6]。采用厂家原装配套试剂，其中部分外院样本的Hb电泳分析在当地区县的医院完成并将数据报送我院。正常参考值：Hb为120～160 g/L(男)、110～150 g/L(女)，MCV为82～100 fL，MCH为27～34 pg，HbA2为2.5%～3.5%，HbF<2.5%。

1.3.3 地贫基因分析 按全血基因组DNA提取试剂盒说明书，采用厦门百维信生物公司的Lab-Aid 820 核酸提取仪提取基因组DNA。获得的DNA应用亚能生物技术有限公司和中山大学达安基因股份有限公司的地贫基因检测试剂盒进行基因检测。检测范围为中国人常见的3种α缺失型地贫(--SEA/、-α4.2/、-α3.7/)，3种α非缺失型地贫(HBA2:c.369C>G、HBA2:c.377T>C、HBA2:c.427T>C)，17种β地贫(HBB:c.126_129delCTTT、HBB:c.52A>T、HBB:c.130G>T、HBB:c.216_217insT、HBB:c.92+1G>T、HBB:c.92+5G>C、HBB:c.316-197C>T、HBB:c.-78A>C、HBB:c.-79A>G、HBB:c.-80T>C、HBB:c.-82C>A、HBB:c.-11_-8delAAAC、HBB:c.2T>G、HBB:c.45_46insG、HBB:c.84_85insC、HBB:c.79G>A、HBB:c.94delC)。按照操作说明书进行实验操作和结果判断。对疑为β地贫而未检出常见突变基因的样本，进一步采用裂缝聚合酶链反应(Gap polymerase chain reaction, Gap-PCR)技术检测SEA-HPFH缺失、中国型Gγ(Aγδβ)0缺失、Taiwanese缺失，目的片段长度分别为420、330、670 bp。

2 结果

2.1 常规基因型及β缺失型地贫结果 在39 170例血液样本中，根据血液学筛查阳性样本的纳入标准，判定为β地贫表型阳性而未检出常规基因型的样本有364例，所占比例为0.93%。在364例加测样本中检出β缺失型地贫105例，检出率为0.27%。包括SEA-HPFH缺失62例，中国型Gγ(Aγδβ)0缺失41例和Taiwanese缺失2例，其中复合α地贫有13例。其中检出6例样本的配偶同为β地贫携带者，属夫妻同型地贫携带者，进行产前诊断。具体结果和基因型别见图1、表1。

2.2 β缺失型地贫携带者的血液学特征 3种β缺失型地贫携带者的血常规检测结果均表现为小细胞低色素，但贫血症状较轻或无贫血。Hb电泳分析：SEA-HPFH缺失地贫携带者大部分样本的HbA2高于正常值3.5%，HbF呈现明显增高；但中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫携带者则不同于常见β地贫点突变携带者，全部表现为HbA2不增高，而HbF与SEA-HPFH缺失地贫携带者一样明显增高；与前两者不一样，Taiwanese缺失地贫携带者虽然HbA2增高，但HbF没有明显的增高。见表2。

1：Marker,2～4：样本；5：阴性对照；6～8：阳性对照；9：空白对照

图1 β缺失型地贫电泳结果

2.3 不同组别的血液学特征 比较SEA-HPFH缺失杂合子和中国型Gγ(Aγδβ)0缺失杂合子的血液学特征，通过正态性检验，6组数据除了HbA2为非正态分布，其余5组数据均为正态性分布。统计学分析，HbA2数据组的U值为176.00(P=0.000)，其余5组数据组详见表3。比较分析发现，除了Hb数据差异无统计学意义(P>0.05)，其他包括MCV、MCH、HbA、HbA2和HbF的5组数据差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 β缺失型地贫基因型分布

β-1为SEA-HPFH，β-2为Gγ(Aγδβ)0，β-3为Taiwanese

项目例数Hb(g/L)MCV(fL)MCH(pg)HbA(%)HbA2(%)HbF(%)SEA-HPFH缺失62129.23±17.4677.27±5.7125.44±1.8277.61±5.983.68±0.7918.71±6.08Gγ(Aγδβ)0缺失41128.32±15.6772.64±5.1624.05±2.2682.55±4.842.42±0.3115.03±4.89Taiwanese缺失2115.00±8.4971.85±7.1422.75±3.1891.31±0.045.09±1.413.60±1.37

项目例数Hb(g/L)MCV(fL)MCH(pg)HbA(%)HbF(%)SEA-HPFH杂合子54130.05±17.4978.16±5.4825.76±1.7177.09±6.1919.31±6.25Gγ(Aγδβ)0杂合子36127.89±15.5272.64±5.3423.98±2.3882.58±5.0615.02±5.12U值0.5994.7274.121-4.6043.430P值0.5510.0000.0000.0000.001

3 讨论

δβ地贫属于β缺失型地贫，是一组血红蛋白病。β缺失型地贫杂合子与β地贫点突变杂合子婚配后，有1/4的机会可能生育中、重型β地贫患儿的风险，是地贫防控的重点类型[7-8]。目前通过人群筛查，对同型夫妇这类高风险家庭行产前诊断，防止中、重型地贫患儿的出生，是目前国内公认的首选有效措施。

本研究中，惠州地区39 170例样本中检出105例β缺失型地贫患者，携带率高达0.27%。其中SEA-HPFH占59.05%，中国型Gγ(Aγδβ)0占39.05%和Taiwanese占1.90%。β缺失型地贫携带者的红细胞参数结果表现为无贫血或轻度贫血，Hb为109～161 g/L，但有明显的小细胞低色素特征，MCV、MCH显著下降，这与文献报道的结果相类似[7-10]。在Hb电泳结果中，SEA-HPFH和中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫携带者都表现了明显的高水平HbF(5.15%～36.48%)。与常见β地贫点突变携带者[11-13]相比较，SEA-HPFH缺失地贫携带者大部分的HbA2升高，但中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫携带者却表现出HbA2不增高。该明显的血液学特征与前期文献报道的一致[2,6-7,14]，且血液学参数范围更大。分析原因，除了因存在个体差异性大，可能由于大样本研究，样本来源较多地区，血液学检查的质控和所用仪器存在一定的差异性。此外，研究发现SEA-HPFH和中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫主要收集于惠东县、博罗县和惠城区3个地区，特别是惠东县的检出率明显高于其他地区，可能因地区人群差异性所导致。惠东县人口组成以客家人为主，这支持了前期报道的“地贫主要分布于客家人，随着客家人祖先的南迁和漂泊传递到世界地区”的推论[15]。与前两者不一样，Taiwanese缺失地贫携带者虽然HbA2增高，但HbF没有明显的增高。不过因该基因型别检出样本例数较小，血液学特征需后期获取更多的阳性样本进一步研究加以验证。统计学比较分析SEA-HPFH缺失杂合子和中国型Gγ(Aγδβ)0缺失杂合子的血液学特征，6组数据中除了Hb组的其他组数据均差异有统计学意义(P<0.05)，这与早期的报道情况一致。

本研究中，3种β缺失型地贫患者的临床症状较轻，其中13例复合了α地贫的样本临床症状更是有所缓解，但当复合其他β地贫时，患者会出现中度至重度贫血，临床表型类似于中、重型β地贫[9-10,16]。因此，检测出6例为SEA-HPFH和中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫且其配偶同为β地贫者，在知情同意情况下均行产前诊断，分别检测出3例正常胎儿、2例β地贫携带者及1例中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫复合β地贫双重杂合子胎儿。其中复合β地贫的胎儿经遗传咨询后，该例患者选择终止妊娠。虽然中国人群中，β地贫主要是因β珠蛋白基因的点突变所致，但本研究发现惠州地区人群的β缺失型地贫携带率也不低，特别是SEA-HPFH和中国型Gγ(Aγδβ)0缺失地贫是比较常见的类型。目前国内各分子实验室常规应用的基因检测技术仅检测17种点突变引起的β地贫，不包括β缺失型地贫。对于β缺失型地贫会漏诊，从而导致中、重型β地贫患儿的出生。因此，若筛查中血液学参数显示为小细胞低色素性贫血，而常规地贫基因未检出，并伴有HbF明显升高，尤其是当HbF>5%时，应考虑β缺失型地贫的可能[6-7]。同理，一个家系中只检测出一个常规地贫基因突变，却生育出了重型β地贫患儿，应考虑β缺失型地贫的可能。总之，在临床遗传咨询中要严格遵循血液学表型与基因型相结合的分析原则，并注意和重视β缺失型地贫的筛查及诊断，预防误诊或漏诊，保证临床诊断的准确性。

综上所述，惠州地区β缺失型地贫携带率高，地贫防控应同时行血常规检测和Hb电泳分析。针对于β缺失型地贫的正确诊断，可为遗传咨询和产前诊断提供更好的依据。本研究中，采集样本量较多，来源较广，检测质量的把控需进一步完善统一的管理文件，且惠州地区存在多种民族，对于少数民族的基因型特征分布情况有待进一步研究，完善地贫数据库。