内异止痛方对子宫内膜异位症大鼠相关mRNA E-cadherin、mRNAβ-catenin的影响*

朱小琳，韩亚光，包 蕾，郭文海，张雪芝，王雪莲，韩延华

（1．黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001；2．黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040）

子宫内膜异位症（EMs）简称“内异症”，是一种慢性、周期性、良性雌激素依赖性疾病，因其发病具有临床隐匿性，形态多样性、病变广泛性、侵袭性和易复发等特点。新近研究报道[1]，育龄期妇女中80%的痛经、50%的不孕症可能与子宫内膜异位症有关，并且呈逐年上升趋势，严重影响女性的身心健康。黏附这一动态过程是异位细胞发生侵袭、转移的第一步，也是内异症发生发展的源起点[2]，而E－钙黏蛋白（E－cadherin）、β－连环蛋白（β－catenin）主要介导上皮细胞间黏附，维持胞间稳定性。因此探讨有效方药调控相关靶基因，是防治本病的关键环节。

①孔底淤积厚度不大于10 cm；②含砂量不大于10%，黏度不大于30s；③密度不大于1.05 g/cm3。

2.2.2 Decomposition of vanillin to small carboxylic acids

1 主要实验方法

1.1 自体移植法构建EMs大鼠模型 将大鼠麻醉后采用自体移植法在大鼠下腹正中、耻骨联合上1cm处（或尿道口上端约1 cm处）做一长约2～3 cm的切口，逐层开腹进入腹腔，于膀胱背侧游离左侧找到并暴露“Y”子宫，结扎子宫系膜血管以及需要切除的子宫上下端，切下左侧子宫长约2 cm，行远端结扎，包埋术。取下后立即放入37℃生理盐水培养皿中，剪去多余的脂肪组织，去除大部分子宫浆膜层及肌层组织，将子宫内膜剪成大小约为5 mm×5 mm组织，内膜面紧贴于双侧腹壁腹膜面，5－0肠线四角缝合于腹部两侧血管丰富处。

1.2 苏木精－伊红（HE）染色法鉴定模型 随机抽取5只造模成功的EMs大鼠，取异位病灶组织常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下组织病理学观察。

内异止痛方药物组成为：三棱10 g，莪术10 g，丹参20 g，鳖甲20 g，桃仁15 g，白芍20 g，连翘15 g，桂枝10 g，甘草10 g，当归15 g，五灵脂10 g，延胡索20 g，香附15 g组成。药物剂型为中药免煎颗粒，购自黑龙江中医药大学附属第一医院门诊中药局（江阴天江公司）。上述药物加蒸馏水混匀后，密封，4℃保存待用。

2 实验药物

1.3 逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测 本实验采用BIOER PCR仪进行扩增，使用iQTM5软件分析PCR过程各检测样品的Ct值，各样本做3个复孔，取其平均Ct值；同时检测各样本PCR反应液的溶解曲线。采用2－△△CT方法进行数据相对定量分析。引物由primer permier 5．0软件设计，由上海invitrogen公司合成，见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

达那唑胶囊，0．2 g×30粒，购自江苏联环药业股份有限公司。

3 实验结果

3.1 异位病灶HE染色结果 HE染色镜下可见EMs模型大鼠异位病灶上皮细胞多见空泡，胞核排列紊乱，间质疏松，并可见新生血管，腺体结构不完整，提示异位内膜组织形成，正常的子宫内膜间质细胞排列紧密，腺体结构清晰，上皮完整，见图1。

图1 假手术组在位内膜A与模型组异位内膜B病理形态学比较（HE染色）Fig.1 Comparison of histopathologic morphology of endometrium in the sham operation A and model group B(HE staining)

E－cadherin和β－catenin是黏附分子复合体结构中的重要组成部分，在介导细胞间黏附、维持血管通透性方面有着不可忽视的作用[3]。血瘀现代研究认为血液运行不畅，或积于脉内，或溢于脉外，可见于各种疾病。胞宫藏泻有度，则月经周期而至，溢出脉外；若肾精不足、肝失疏泄、脾失健运损伤冲任，胞宫藏泻失常而致经血不循常道形成“离经之血”。反之，瘀血内结，气血运行不畅，新血不得归经，进一步加重瘀血形成，形成恶性循环。许多学者研究发现，子宫内膜异位症患者的血液大多处于浓稠黏聚状态，流动缓慢，与中医血瘀证特点相似，进一步证实了血瘀为子宫内膜异位症的核心病机[4]。

表2 各组E-cadherin、β-catenin基因转录水平（x±s）Tab.2 Level of E-cadherin andβ-catenin gene transcription of each group

表2 各组E-cadherin、β-catenin基因转录水平（x±s）Tab.2 Level of E-cadherin andβ-catenin gene transcription of each group

注：与假手术组比较，*P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．01；与中药低剂量组比较，△P＜0．01。

组别 E－cadherin mRNA（2－△△CT） β－catenin（2－△△CT）模型组 0．699±0．086* 43．211±3．452*中药低剂量组 12．421±0．921# 32．069±2．868#中药高剂量组 22．496±2．413#△ 17．569±1．662#△阳性药物组 33．277±3．244# 7．961±1．013#假手术组 1 1

4 讨论

3.2 内异止痛方对E－cadherin、β－catenin基因转录水平的影响 与假手术组相比，模型组E－cadherin转录水平显著降低且β－catenin基因转录水平显著升高（P＜0．01）；与模型组相比，各治疗组基因转录水平E－cadherin显著升高、β－catenin显著降低（P＜0．01）；阳性药物组各基因转录水平优于中药治疗组（P＜0．01）；中药高剂量组各基因转录水平优于低剂量组（P＜0．01），提示中药治疗组可有效升高异位病灶组织E－cadherin mRNA、降低β－catenin mRNA基因转录水平，且中药高剂量组优于中药低剂量组（P＜0．01），差异有统计学意义，说明内异止痛方在改善异位病灶组织基因转录水平上疗效显著。见表2。

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

内异止痛汤是导师韩延华教授临床应用近20年的治疗子宫内膜异位症的经验方，具有活血化瘀、缓急止痛之力，能够改善子宫内膜异位症的临床症状。方中三棱、莪术两药相和，即为三棱丸，最早见于《经验良方》，共为君药，三棱为血中之气药，莪术为气中之血药，“专走肝家，破积聚恶血”，两药合用散尽一切血瘀气结。延胡索、香附、五灵脂、丹参4药合用共为臣药，具有疏肝行气、活血止痛之功。鳖甲软坚散结而潜阳，桃仁活血祛瘀而生新，当归补肝体之阴，白芍养肝血平肝痛、桂枝配白芍，可温通经脉，缓急止痛，连翘取其清热解毒散结之功效。使药一味甘草，缓急止痛，调和诸药。

此外，对于预防子宫内膜异位症的发生，导师提出了几点建议：1）合理性生活：防止经血逆流，要做到“合之有道”，即不在经期或经期前后发生性生活、尽量减少或避免宫腔内操作。2）调畅情志：女子为病，素性抑郁，病位在肝，故多以情志不遂为多，并认为EMs疾病的预防，首先要做到调畅情志，正如古人所言：“一身血气周流，无有阻滞，则百病不生”。因此，在现代繁忙紧张的环境下，每个人都要保持宽广的胸怀和无私的情操，并且还要不断提高自身的文化修养，只有遵守这个原则，才能有利于保持心情愉悦。