人前列腺间充质干细胞在不同培养条件下体外诱导分化能力的初步研究

张戈垚 黄翔华

【摘要】间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于人体发生、发育过程的许多种组织中，前列腺中也存在MSCs。体外分离培养MSCs所采用的体系一般分为无血清培养体系和有血清培养体系。本研究选取常规无血清MSCs培养液和MEMɑ+10%MSCs金牌血清培养液这两种培养体系同时培养人前列腺间充质干细胞（human prostate-derived  mesenchymal stem cells，hPMSCs），观察培养后的人前列腺间充质干细胞诱导分化能力的差异，从而推测有无血清的培养体系对人前列腺间充质干细胞的影响。研究结果表明，与无血清间充质干细胞培养液比较，MEMɑ+10%间充质干细胞金牌血清培养液中的人前列腺间充质干细胞体外分化能力完全，符合间充质干细胞分化能力标准。本研究结果为临床和实验室科研选用适宜的培养体系提供了初步的依据。

【关键词】人前列腺间充质干细胞;培养条件;分化

【中图分类号】R181.3+2【文献标志码】A【文章编号】1005-0019（2019）02-004-02

1研究背景

1.1人前列腺间充质干细胞简介

近年来研究发现，在机体的大多数器官中均具有MSCs，具有较强的细胞增殖和多分化潜能，在组织器官的损伤修复中有重要的作用[1]。良性前列腺增生包含腺体和间质组织增生，正常前列腺的间质细胞与皮质细胞比例为2：1，在前列腺增生组中，间质细胞与皮质细胞之比升高为5：1，随着年龄增加，细胞增殖能力大大降低[2，3]。目前，我们能够从肌肉、骨髓、肺、脂肪、肝、胰腺等组织以及脐带血、羊水中制备MSCs[1]。有研究发现在前列腺中也存在MSCs，有关它们的分化能力罕有报道[4]。

1.2MSCs体外分化能力和鉴定

体外分离培养MSCs所采用的体系一般包括有血清和无血清培养体系，前者为医用级MSCs采用，后者多为实验室研究级MSCs采用[5，6]。

MSCs在体外特定条件下可分化为多种中胚层来源的细胞[7]。通过对定向分化细胞的检测来确定MSCs在不同培养基中分化能力是否存在差异[8-10]。

油红O染料（Oil Red-O）属于苏丹染料家族的一员，是一种脂溶性的偶氮染料[11]。由于在成脂分化作用下，间充质干细胞会先后诱导分化为前成脂细胞和脂肪细胞，后者聚集着大大小小的脂肪滴，油红O在脂肪中的溶解度大于其在染液中的溶解度，因而使脂肪着色，呈现红色或橘红色。

茜素红S（Alizarin Red S）是一种常用示钙染剂，广泛用作生物医学样本中含钙目标物的染色检验。游离的钙离子可与茜素红S形成红色沉淀，固着的钙则会被直接染成红色。在成骨诱导分化作用下，间充质干细胞会被逐渐分化为骨细胞，包括钙化骨节（钙盐结晶体）的形成和细胞的泌钙反应，两者均可被茜素红S染成红色。

阿尔新蓝8GX（Alcian Blue 8GX）是阿尔新蓝家族的一种，广泛用于酸性多糖的染色，例如软骨或其他组织中的糖胺聚糖以及细胞分泌的外被多糖等。在软骨诱导分化作用下，间充质干细胞会被诱导成为软骨细胞。软骨细胞外具有一层富含蛋白多糖的基质，是软骨分化的标志物，可被阿尔斯新蓝染成蓝色或蓝绿色。Alcian Blue染色是成熟软骨细胞的标志。

2研究目的和意义

2.1研究目的

实验室细胞培养用血清成分不确定，因血清品质和添加量不同，其中的因子对MSCs的影响有差异。市场销售的间充质干细胞成品培养液多为无血清培养液，成分明确，但适用细胞类型有限。本研究选取Biological Industries公司出品的常规无血清间充质干细胞培养液和MEMɑ+10%间充质干细胞金牌血清培养液这两种培养体系，观察分离且鉴定过的hPMSCs诱导分化能力的区别，从而推测有无血清对hPMSCs的影响。

2.2研究意义

干细胞是一类有自我更新和多分化潜能的细胞，在特定条件下，它们可转变为一种或多种细胞。有关人类MSCs的研究最终的目标均是希望应用于临床。目前间充质干细胞已经在解决多种疾病方面有重大突破。但是考虑到动物血清的临床使用风险，市场提供的成品培养液均是无血清产品，这些产品适用MSCs类型有限，为满足多种类型MSCs的临床研究需要，我们必须要关注新型间充质干细胞在使用常规有血清和无血清培养体系中的分化差异，该类比较研究未见报道。

3材料与方法

3.1材料与试剂

建系的人间充质干细胞由内蒙古自治区人民医院泌尿外科研究所提供，MEMɑ基础培养液、间充质干细胞金牌血清、MSC NutriStem XF成品培养液、成脂诱导分化液、成骨诱导分化液、成软骨诱导分化液、成脂分化染色液试剂盒、成骨分化染色液试剂盒、成软骨分化染色液试剂盒、MSC Attachment solution均由Biological Industries公司提供。

3.2仪器与设备

15ml离心管、50ml离心管、24孔细胞培养板（均购自Corning公司）;细胞培养箱（Thermo公司）、1000μl移液器、无菌注射器、0.22μm无菌滤器、倒置显微镜（Nikon）、超净工作台、冰箱

3方法

（1）hPMSCs诱导分化培养基的配制

①成脂分化完全培養基的配制：

室温下解冻2 个Supplement Mix（Mix I 和Mix II），将0.1 ml Supplement Mix I 与 1.5 ml Supplement Mix II 加入到100 ml Adipogenic Basal Medium 中，即为诱导成脂分化完全培养基。该完全培养基可在2-8°C 储存一个月。

②成脂分化完全培养基的配制：

MSC go Osteogenic XF是即用型完全培养基。

③成软骨分化完全培养基的配制：

室温下解冻Supplement Mix，将Supplement Mix 和Chondrogenic Basal Medium 以1：10 的比例混合即为完全分化培养基（如：10 ml Supplement Mix + 100 ml Basal Medium）。

该完全分化培养基可在2-8°C储存一个月。

（2）接种hPMSCs：

用MSC Attachment solution （BI： 05-752-1，1：100 DPBS 稀释使用） 预包被一个24孔细胞培养板18孔，其中9孔加入1 ml/孔 MSC NutriStem XF成品间充质干细胞无血清培养液，接种0.75x105 细胞。剩余9孔加入1 ml/孔MEMɑ基础培养液+10%间充质干细胞金牌血清的混合液，接种0.75x105细胞。将24孔细胞培养板放于37°C，5% CO2培养箱中。培养24 h 后，当细胞融合度达到80-90%时，分别将MSC NutriStem XF 培养基和MEMɑ基础培养液+10%间充质干细胞金牌血清的混合液吸除。每3孔细胞分为一组，每种培养液体系各有3组，这3组分别加入1ml/孔成脂分化培养基、成骨分化培养基和成软骨分化培养基。将24孔细胞培养板置于37 °C，5% CO2培养箱中培养14-21天，期间每3天换液一次。

（3）hPMSCs分化的染色鉴定

①成脂诱导分化染色鉴定

（A）染色前，将Adipo-Staining A与Adipo-Staining B （C37A40010） 按3：2的体积比混合，即为染色工作液（Staining Solution）。每次使用现用现配，3 小时内使用。

（B）吸弃分化培养基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A）轻轻润洗培养瓶底面

（C）吸弃DPBS，加入3 ml Adipo-Fixation （C37A10020），轻轻晃动培养瓶，使底面浸润均匀，室温下静置30 分钟。

（D）吸弃Adipo-Fixation，加入3 ml Adipo-Wash I （C37A20050），润洗底面，静置2-3min

（E）吸弃Adipo-Wash I，加入3 ml Staining Solution使底面浸润均匀，室温下静置30 min。

（F）吸弃Staining Solution，加入3mlAdipo-Wash II （C37A50050），

（G）吸弃Wash II，重复（F），再次漂洗细胞（如若上清依然很红，可延长漂洗时间或再漂洗一次）。

（H）加入1 ml Adipo-Inspection（C37A60010），置于显微镜下观察、拍照

②成骨诱导分化染色鉴定

（A）吸弃分化培养基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A） 轻轻润洗培养瓶底面

（B）吸弃DPBS，加入3 ml Fixation solution（C37C10020），轻轻晃动培养瓶，使底面浸润均匀，室温下静置30 分钟

（C）吸弃Fixation solution;加入3 ml Wash I （C37C20050），潤洗细胞2-3 次

（D） 吸弃Wash I，加入3 ml StainingSolution （C37C30020），底面浸润均匀，室温染色30 分钟

（E）吸弃Staining Solution，加入3 ml Wash II （C37C40050），润洗细胞2-3 次

（F）吸弃Wash II，加入1 ml Inspection Solution（C37C50010），置于显微镜下观察、拍照（细胞会被染成橘红色）。

③成软骨诱导分化染色鉴定

（A）吸弃分化培养基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A） 轻轻润洗培养瓶底面。

（B）吸弃DPBS，加入3 ml Fixation solution （C37B10020），轻轻晃动培养瓶，使底面浸润均匀，室温下静置30 分钟。

（C） 吸弃Fixation solution，加入3 ml Wash I （C37B20050），润洗细胞，静置2-3 分钟

（D）吸弃Wash I，加入3 ml Staining Solution （C37B30020），底面浸润均匀，室温避光染色过夜

（E）吸弃Staining Solution，加入3 ml Wash II （C37B40050），润洗细胞。

（F）吸弃Wash II，重复第5 步，再次漂洗细胞（如若上清依然很蓝，可延长漂洗时间或再漂洗一次.注意：不要把细胞冲下来）。

（G）加入1 ml Inspection Solution（C37B50010），置于显微镜下观察、拍照。

4结果分析

在MSC NutriStem XF无血清培养液中培养的人前列腺间充质干细胞诱导分化后，成脂分化结果未见红色油脂滴形成;成骨分化偶见茜素红S形成的红色沉淀;成软骨分化可见蓝绿色结构（图1）。这提示MSC NutriStem XF无血清培养液中培养的人前列腺间充质干细胞体外成脂分化有障碍。相较而言，在 MEMɑ基础培养液+10%间充质干细胞金牌血清中培养的人前列腺间充质干细胞诱导分化后，可见红色油脂滴形成，说明成脂分化成功;成骨分化可见大量的茜素红S形成的红色沉淀;成软骨分化可见明显蓝绿色结构（图2）。这说明该体系培养的人前列腺间充质干细胞体外分化能力完全，符合间充质干细胞分化能力标准。虽然这一体系含有血清，但该体系培养的人前列腺间充质干细胞性质稳定。

5讨论

5.1创新

截至目前，未见有关比较人前列腺间充质干细胞在有血清和无血清培养体系中培养后体外诱导分化能力比较的报道。分析这一分化能力的差异，可为临床和实验室科研挑选适宜的维持人前列腺间充质干细胞性质稳定的培养体系提供实验依据。比起人血清的风险，更应该注重细胞性质的稳定。

5.2展望

本项研究仅简单探讨了不同培养体系中人前列腺间充质干细胞体外诱导分化能力的差异，并未深入引起这种差异的的深层次原因。今后我们将分析引起这种差异的关键基因或蛋白质，为临床和科研需求提供更为详尽的研究基础。

参考文献

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