响应曲面法优化米炒党参炮制工艺研究＊
2019-03-06吕辰子何美菁孟祥龙刘丽婷张朔生
吕辰子，何美菁，王 勃，孟祥龙，2，刘丽婷，张朔生＊＊
（1.山西中医药大学中药学院 晋中 030619；2.东国大学东方医学院 庆州 38066）
党参为桔梗科党参属植物党参Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.、素花党 参Codonopsis pilosulaNannf.var.Modesta(Nannf.) L.T.Shen 或川党参Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，秋季釆挖，洗净，晒干[1]。党参为我国传统补益药，应用广泛。据现代药理研究表明[2]，党参具有调节血糖、增强机体免疫力、促进造血机能、抗缺氧、抗应激、耐疲劳、延缓衰老、调节胃收缩等多种作用，目前已被国家卫计委列入药食两用品种名单。米炒是指将净制或切制后的饮片与大米共同拌炒的方法。大米性甘味平，具有补中益气、调理脾胃、止渴、止泻痢的作用[3]，党参经米炒之后，气变清香，可以增强其健脾止泻的作用[4,5]，用于脾胃虚弱，食少，便溏。党参炔苷是党参中的主要活性成分，有抗癌、抗菌、抗炎、镇静降压作用，还能调节前列腺代谢，可作为党参研究的指标性成分[6,7]。本试验以党参炔苷含量为评价指标，采用HPLC 测定方法和响应曲面试验法优化米炒党参工艺参数，为今后规范党参炮制工艺、制订合理的饮片质量标准提供参考。
1 器材
1.1 实验仪器
CZB1002 电子秤（诸暨市超泽街器设备有限公司），电磁炉（江门市威多福电器有限公司），万能高速粉碎机RRHP-100 型，EX125ZH 分析天平（奥豪斯仪器有限公司），超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，HH-2 型电热恒温水浴锅，U-3 000 型高效液相色谱仪（美国Thrmo Fisher Scientific公司）
1.2 实验试剂及药材
大米，党参饮片，经山西中医药大学中药学院张朔生教授鉴定为生党参饮片正品，党参炔苷对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度≥98%（批号4623），甲醇为分析纯（天津市科密欧），乙腈为色谱纯。
2 实验方法与结果
2.1 标准品溶液及样品的制备
2.1.1 米炒党参样品制备
将大米置热的炒药锅内，用中火加热至米冒烟时，投入党参片拌炒，至党参呈黄色时取出，筛去米，放凉，打粉，过药典4号筛即可。
2.1.2 标准品溶液的制备
取党参炔苷对照品5 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容，0.45 μm 微孔滤膜滤过，得浓度为0.5 mg·mL-1，得-1的党参炔苷对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
取米炒党参粉末2 g，置100 mL 锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声1 h 后，取出，用甲醇补足减失的重量，滤过。取25 mL 水浴蒸干，再用甲醇溶解，定容至10 mL，0.45 μm 微孔滤膜滤过，制得供试品溶液备用。
2.1.4 含量测定色谱条件
Uetimate3 000 系列高效液相色谱仪，配DAD-3 000(RS)检测器，反相高效液相色谱法，Thermo Hypersil GOLD（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈—水（28∶72）；流速1 mL·min-1；检测波长270 nm；柱温25℃；进样量为10 μL；党参炔苷在267 nm 处有最大吸收值，因此选择267 nm 作为检测波长[6]。
对照品及样品色谱图（图1，图2）。
2.2 方法学考察
2.2.1 线性范围考察
取党参炔苷对照品适量，精密称定，置于25 mL容量瓶定容，制得浓度为0.5 mg·mL-1定容-1的党参炔苷对照品溶液，作为备用液。分别取对照品溶液1，2，3，4，6 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，分别制成浓度为0.05 mg·mL-1，0.1 mg·mL-1，0.15 mg·mL-1，0.2 mg·mL-1，0.3 mg·mL-1的对照品溶液，进样量为10 μL，以峰面积对进样浓度进行回归，得到回归方程：y=168.93x+8.821 3（R2=0.999 4），表示党参炔苷在0.05-0.3 mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.2.2 精密度实验
取党参炔苷对照品储备液连续进样6 次，每次10 μL，计算党参炔苷峰面积，得到RSD 为0.91%，证明其精密度较好，结果见表1。
2.2.3 稳定性实验
取炮制后的党参粉末2 g，精密称定，按照“2.1.3”项下制备供试品溶液的方法制备，分别于配置后0，1，2，4，6，8，10 h 进样，测定峰面积，求RSD，评定其稳定性。得到其RSD 为0.71%，证明在10 h 内其稳定性良好（表2）。
表1 精密度实验
表2 稳定性试验
图1 党参炔苷对照品高效液相色谱图
图2 党参供试品高效液相色谱图
2.2.4 重复性实验
精密称取炮制后党参粉末6 份，每份约2 g，按照“2.1.3”项下制备供试品溶液的方法制备，测定党参炔苷的平均含量，评定该分析方法的精密度。计算RSD为2.42%，表明其重复性良好（表3）。
2.2.5 加样回收率实验
取炮制后党参粉碎，取6 份，每份1 g，按照上述样品的制备方法制备好待测，每份中加入0.1mg·mL-1的党参炔苷对照品溶液各1 mL，回收率（%）=（测得总量-供试品中所含被测成分量）/加入的对照品的量×100%。测得加样回收率为97.4%，RSD为0.91%（表4）。
表3 重复性实验
表4 加样回收实验
图3 不同温度下炮制对党参炔苷含量的影响
图4 在不同的炮制时间下对于党参炔含量的影响
图5 米与党参不同配比对于党参炔苷含量的影响
表6 Box-behnken设计实验
3 实验内容
3.1 单因素实验
3.1.1 炮制温度的考察
图6 米炒党参炮制温度与炮制时间对党参炔苷含量的影响
图7 米炒党参炮制温度和辅料与药物之比对党参炔苷含量的影响
选择炮制时间为3 min，党参与米量之比为2∶1，将温度设置为60℃、100℃、130℃、160℃、180℃、210℃，考察温度变化对党参炔苷含量的影响，测定结果如图3，得到最佳炮制温度为180℃。
3.1.2 炮制时间的考察
选择炮制温度180℃，党参与米量之比为2∶1，设置炮制时间为1 min、2 min、4 min、6 min，考察炮制时间对于党参炔苷含量的影响，测定结果如图4，得到最佳的炮制时间为2 min。
3.1.3 辅料与饮片质量之比的考察
选择炮制温度为180℃，炮制时间为2 min，选择辅料与党参的比例为1∶10、2∶10、6∶10、10∶10，考察比例关系对党参中党参炔苷含量的影响，测定结果见图5，得到最佳的物料比为6∶10。
3.2 响应曲面实验
根据米炒党参单因素实验的结果，得到较好的单因素：炮制温度为180℃、炮制时间为2 min、辅料与党参的比例为6∶10。以此设定因素水平表如下（表5，表6）。
由Design-Export 8.0.6 软件分析处理得到的相应曲面（图6，图7，图8）：
3.3 实验分析
由三维的立体模型图以及实验结果得到的相应的二次方程模型：党参炔苷含量=0.32+0.015A-0.050 B -4.138 × 10-3C+0.010AB -7.025 × 10-3AC +0.037BC-0.081A2-0.11 B2-0.056C2。R值为0.9556，说明该模型能解释95.56%响应值的变化，因而该模型的拟合程度比较好，试验误差小，可以用此模型进行分析和预测。
由方程及回归分析可以得到，B 因素即炮制时间对于党参炔苷含量的影响较为显著，由表7 可得各因素对于党参炔苷含量影响的顺序：炮制时间二次项＞炮制温度二次项＞炮制时间一次项＞辅料与药物之比二次项＞炮制时间、辅料与药物之比双因素＞炮制温度的一次项＞辅料与药物之比、炮制温度的双因素＞炮制时间与炮制温度的双因素影响＞炮制物料比一次项的影响。
3.4 实验结果
党参炔苷在最中心处所对应的条件下含量最高，由Design-Export 8.0.6 优化处理的到最佳米炒党参炮制工艺参数为：炮制温度为182.77℃、炮制时间为1.76 min、辅料与药物的比例为55∶100，预测党参炔苷的含量值为0.328 1 mg·mL-1（图6，图7，图8）。
图8 米炒党参炮制时间和辅料与药物之比对党参炔苷含量的影响
表7 回归分析结果
表8 米炒党参验证实验
3.5 验证实验
在最佳的炮制工艺条件下进行三组平行实验，对该炮制工艺进行验证（表8）
采用实验得到的最佳条件设计实验，米炒党参测定得到党参炔苷含量为0.326 3 mg·g-1，与预测值相接近，说明利用响应曲面法对炮制工艺拟合效果好。
4 讨论
规范中药饮片及其炮制品生产工艺，制定相关质量标准是中药可持续发展的基础。党参炔苷作为党参标志性成分，收录于2015版《中华人民共和国药典》中党参鉴别项下。本实验运用响应曲面法考察了米炒党参的炮制温度、炮制时间、辅料与药材之比对党参炔苷含量的影响，进而对米炒党参的炮制工艺进行优化，得到最佳炮制工艺。传统的工艺优化通常采用正交试验设计，响应曲面法与之相比虽然试验次数相对较多，但它能把因素与响应值的相互关系函数化，建立连续变量曲面模型，考察的因素不局限于所设计的水平，能更直观、精确地得到最优组合条件，能更好的反应各因素之间的相互作用。
目前有研究表明[8,9]，党参米炒后5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量增加，并能调控胃肠平滑肌兴奋性收缩。党参多糖与阿魏酸等有机酸共同加热是生成5-HMF 的主要途径。在本试验基础上可以继续药理试验，结合党参米炒前后党参炔苷和5-HMF 含量变化，以及相关药理试验指标，为进一步阐释米炒党参炮制机理提供借鉴。
