基于网络药理学探讨“红花-桃仁”药对防治冠心病的作用机制＊

高 源，季 伟，肖 丹，刘 井，彭丹冰，彭 源

（1.贵州省食品检验检测所 贵阳 550004；2.武警贵州省总队医院 贵阳 550005）

桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟种子；苦、甘，平；归心、肝、大肠经；具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘之功效，主治经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤，肠燥便秘等症。红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花；辛，温；归心、肝经，具有活血通经，散瘀止痛之功效，主治经闭，痛经，恶露不行，癥瘕痞块，胸痹心痛，疮疡肿痛等症[1]。红花、桃仁两者配伍使用是中医活血化瘀经典而常用药对之一，始于《医宗金鉴》桃红四物汤，临床疗效显著，后世延续至今。桃仁不仅能活血化瘀，而且还能推陈致新，适应于多种血瘀证；红花为“活血通经止痛”之要药；以红花-桃仁药对为基础的著名药方有补阳还五汤、复元活血汤、血府逐癖汤、桃仁当归汤、红花桃仁煎等[2,3]。目前，关于红花、桃仁单味药的化学成分、药理研究及作用机制的报道较多[4-13]，但从细胞及分子水平进行系统全面的揭示“红花-桃仁”药对以何种药效成分通过何种途径发挥防治冠心病的配伍机制鲜见报道。传统中医药（理、法、方、药）由于缺乏分子生物学的表征,无法发挥其独特的优势，难以与现代科学有机的融合[14]；且“红花-桃仁”药对配伍使用化学成分更为复杂，给深入研究其药效物质基础和作用机制带来困难。近年来，网络药理学整体性、系统性的特点与中医整体观念、辨证论治的理论及中药“多成分、多途径、多靶点”协同作用的特点不谋而合，为中医药复杂系统的研究提供了新的视角和思路[15-19]。因此，本文采用网络药理学的方法，对“红花-桃仁”药对活性成分防治冠心病的作用靶点及信号通路进行分析，以期揭示“红花-桃仁”药对防治冠心病的配伍机制，为“红花-桃仁”药对的深入研究及开发利用提供现代科学内涵。技术路线见图1。

图1 基于网络药理学的“红花-桃仁”药对防治冠心病作用机制的技术路线图

1 方法

1.1 化学成分的建立

通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索与“红花-桃仁”药对所含的全部化学成分，桃仁中共含有66 个化学成分，红花中共含有189 个化学成分，因此，“红花-桃仁”药对中总共含有255个化学成分。

1.2 活性成分的筛选

通过查阅相关文献（CNKI、PubMed）、TCMSP 数据库，以ADME 参数（OB（E 以%和DLE 以d 文献）及药效活性为标准，筛选“红花-桃仁”药对的活性化学成分。

1.3 靶点的筛选与建立

通过TCMSP数据库、BATMAN-TCM 数据库、中药靶标数据库综合分析，以Score cutoff 得分及P-value值等为标准，进行“红花-桃仁”药对中活性成分作用靶点的筛选，建立靶点数据集。再依据相似性比较，将筛选出的活性成分对应的靶点，通过中草药活性成分数据库（HIT，http://lifecenter.sgst.cn/hit/）和治疗靶点数据库（TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）进行活性成分潜在靶点的筛选，建立“红花-桃仁”药对潜在靶点数据集，并通过人类基因和基因表型综合数据库（OMIM，http://www.omim.org/）筛选“红花-桃仁”药对防治冠心病的基因和蛋白靶点，建立冠心病靶点数据集。人类的靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库（http://dip.doe-mbi.ucla.edu）获得。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt数据库查询转化成UniProt ID格式。

1.4 网络构建与分析

通过PPI（http://www.genome.jp/kegg/）分析，将“红花-桃仁”药对的活性成分、成分对应的靶点、冠心病对应的靶点和交互蛋白对应的靶点连接成“成分-靶点-疾病”网络。利用Cytoscape 3.6.1 软件将以上网络进行可视化分析，得到每个节点的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality 三个拓扑参数通过CentiScaPe 1.2 进行评估，选择以上3 个拓扑参数值满足分别大于所有点中位数值的靶点，作为“红花-桃仁”药对防治冠心病的目标靶点。

1.5 生物过程分析

将筛选出的目标靶点使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库进行KEGG 通路分析和GO（Gene Ontology）生物学过程分析。然后再利用STRING（https://string-db.org/）对所筛选出的目标靶点进行蛋白互作关系分析。

1.6 构建“红花-桃仁”药对防治冠心病的通路图

利用KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）信号通路数据库中的KEGG Mapper 功能将活性成分作用的潜在靶点，在与冠心病最为密切的信号通路上标注出来，验证中医药配伍机制是通过多靶点、多途径协同发挥治疗作用。

2 结果

2.1 活性组分的筛选

通过TCMSP 数据库和TCMID 数据库，共查找得到“红花-桃仁”药对255 个化学成分，以ADME 参数（OB（E分%和DLE 分，以得）及药效活性为标准，共筛选得到38个活性化合物，其中与红花相关的化学成分有21个，与桃仁相关的化学成分有17个，结果见表1。

2.2 药物靶点和疾病靶点数据的筛选

通过TCMSP数据库、BATMAN-TCM 数据库、中药靶标数据库综合分析，以Score cutoff得分及P-value值等为标准，筛选得到“红花-桃仁”药对活性化合物各自对应的药物作用靶点数，结果见表1。通过网络药理学构建出“红花-桃仁”药防治冠心病作用的交互网络，采用不同颜色和形状图形使其可视化后，可直观的看出化学成分与疾病靶点之间的网络关系，结果见图2。其中，黄色方形代表药物与疾病共同作用的靶点，也是“红花-桃仁”药对防治冠心病作用最重要的靶点蛋白；黄色圆点代表冠心病直接作用靶点；红色三角形代表“红花-桃仁”药对中筛选出的活性化合物；蓝色圆点代表活性化合物的直接作用靶点；紫色圆点代表连接活性化合物与疾病靶点的交互蛋白。

2.3 “红花-桃仁”药对防治冠心病的直接作用靶点拓扑参数分析

通过Cytoscape 3.6.1 软件进行交互网络分析，得到“红花-桃仁”药对活性成分相关联的蛋白靶点，并对这些靶标蛋白进行拓扑参数计算。以网络中所有点 的（Degree、Betweenness centrality 和 Closeness centrality）中位数均值作为计算结果，得到三个拓扑参数分别为：4.0、0.002 1 和0.275 9。将三个拓扑参数值均大于中位数均值的靶点作为红花-桃仁”药对防治冠心病的潜在靶点蛋白，共得到10个靶点满足以上条件，结果见表2。将潜在靶点蛋白进行蛋白相互关系分析，结果见图3。蛋白相互关系分析说明“红花-桃仁”药对防治冠心病的潜在靶点蛋白相互关联和彼此调节。

2.4 GO生物学功能分析

将10 个潜在靶点映射到DAVID 数据库中，进行GO 生物学功能富集分析，共富集得到66条生物过程，其中P 值≤≤物过程的生物过程共有22 条，结果见表3。结果表明，“红花-桃仁”药对防治冠心病与多条生物过程的调控相关，其中最为密切的生物过程包括脂多糖介导的信号通路、序列特异性DNA 结合转录因子活性的正调控、蛋白磷酸化的正调控、蛋白激酶B信号转导、一氧化氮生物合成过程的正调控等。反映了“红花-桃仁”药对防治冠心病的配伍机制涉及体内多个生物过程的异常，同时也表明了“红花-桃仁”药对活性成分可能是通过调节这些生物过程发挥防治冠心病的作用。

表1 结红花-桃仁”药对活性化合物及靶标数

图2 中红花-桃仁”药对防治冠心病的“成分-靶点-疾病”交互网络

表2 对红花-桃仁”药对活性成分防治冠心病的直接作用靶点相关拓扑参数

图3 “红花-桃仁”药对防治冠心病的潜在靶点蛋白相互关系图

2.5 KEGG 通路分析

将10 个潜在靶点映射到DAVID 数据库中，进行KEGG 通路富集分析，共富集得到18 条信号通路，结果见表4。其中7 条通路（P 通路）与“红花-桃仁”药对防治冠心病的作用密切相关，包括肿瘤坏死因子信号通路、疟疾、非洲锥虫病、NOD 样受体信号通路等。图4 为“红花-桃仁”药对活性成分潜在靶点在肿瘤坏死因子关键信号通路上的标注图。

3 讨论

表3 活红花-桃仁”药对防治冠心病作用的GO生物学功能富集分析结果

表4 活红花-桃仁”药对防治冠心病作用的KEGG通路富集分析结果

图4 红花-桃仁”药对活性成分潜在靶点在关键信号通路上的标注图

传统中医药防治疾病的精髓是通过相互配伍，发挥“多成分、多靶点、多途径”协调作用的特点，但是配伍后化学成分的种类繁多复杂，难以阐明药效物质基础和作用靶点，给中医药配伍机制的研究带来了难题。“红花-桃仁”药对是中医配伍中常见的活血化瘀药对，两者通过中药“七情”中的相须相互协同增效。网络药理学通过挖掘大量数据，构建“成分-靶点-疾病”复杂网络图，为中药药效物质基础和作用机制的研究提供了新的思路和方法，进一步推动了中医药的快速发展。目前，有关红花、桃仁单味药作用机制的研究比较集中，秦秀德等[20]MCAO 大鼠模型发现红花注射液对急性脑梗死脑组织具有保护作用，相关机制可能是通过上调GRP78 表达和下调CHOP 介导CRP途径发挥作用。刘楠等[21]通过MDA-MB-435 细胞证实红花多糖能够显著降低PI3K、Akt、mTOR mRNA 和蛋白表达，其作用机制可能是通过阻断PI3K/Akt/mTOR 信号通路实现的。李小波等[22]采用单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型，发现桃仁、红花及其药对可通过升高肾组织E-cadherin 和降低肾组织ILK、FN 及ααK肾组的表达来减缓肾间质纤维化，结果表明桃仁-红花药对的效果最好。以敏等[23]采用寒凝血瘀证和瘀热互结证的大鼠模型，研究桃仁改善血管内皮功能的差异及可能的机制，结果显示桃仁可同时改善寒热不同血瘀证体征，降低两证血管内皮细胞损伤；桃仁对寒凝血瘀证和瘀热互结证，可能的机制是通过调节NF-证，通路来实现的。

本文采用网络药理学的研究方法，通过数据库检索得到了“红花-桃仁”药对38 个活性化合物，筛选出了718 个活性化合物对应的作用靶点，并以活性化合物和靶点构建了“成分-靶点-疾病”交互网络图。通过网络拓扑参数分析，筛选出10 个潜在作用靶点，提示这些潜在靶点蛋白可能直接或间接参与防治冠心病的作用。通过GO 富集和KEGG 通路注释分析结果，发现18 条信号通路及66 个生物过程参与“红花-桃仁”药对防治冠心病的作用，其中与防治冠心病相关的信号通路包括肿瘤坏死因子信号通路、疟疾、非洲锥虫病、NOD 样受体信号通路等，这些信号通路主要涉及的生物过程包括脂多糖介导的信号通路、序列特异性DNA 结合转录因子活性的正调控、蛋白磷酸化的正调控、蛋白激酶B信号转导、一氧化氮生物合成过程的正调控等。由此推断，“红花-桃仁”药对防治冠心病可能与肿瘤相关信号通路密切相关。

运用网络药理学挖掘和筛选，“红花-桃仁”药对活性成分，并对其作用靶点与机制进行初步的筛选与分析，以期为“红花-桃仁”药对的药效实验提供参考依据，也为药对中医配伍机制的深入研究及开发利用提供了现代科学内涵。