小檗碱介导LncRNA-MIAT调控自噬抑制心肌细胞肥大的机制研究＊

曾志聪，林丰夏，张元贵，吴 伟，宋银枝，李亮＊＊

（1.深圳市宝安中医院（集团）心血管病科 深圳 518100；2.广州中医药大学第一附属医院 广州 510006）

心力衰竭（心衰）是各种心血管疾病的终末期阶段，目前的发病率及死亡率居高不下[1]。当高血压、心脏瓣膜病等致心脏压力负荷过重时，心脏会代偿性的出现心肌肥厚，表现为心肌肥大，蛋白表达的增加，以增强心室收缩功能，目的是对抗过高的压力负荷，维持心脏泵血功能的稳定[2]。虽然早期心肌肥大对于维持正常心功能具有一定的代偿意义，但是这种刺激持续存在将会引起交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统等神经内分泌系统的过度激活，释放血管紧张素及儿茶酚胺类等激素，造成心肌细胞氧耗量的增加，一旦心脏血供不能满足肥厚心肌的需求时，即会发生心衰，显著增加恶性心律失常、心源性猝死的风险性，严重威胁人类生命。因此，对于早期心肌肥大的抑制可以延缓其进入心力衰竭期，降低心衰的死亡率。目前认为长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）在心衰治疗中应用潜力巨大，其原因在于它可以通过在分子水平上的巨大调控力影响细胞的稳态，并进一步影响疾病的发展[3-5]。其中，有研究发现长链非编码RNA-MIAT（LncRNA-myocardial infarctionrction-associated transcript,LncRNA-MIAT）在病理或应激状态下，可以通过调控自噬参与心肌肥大的发展过程[6,7]。

中医药是中华民族原创的医学科学，蕴含着解决人类健康问题的宝贵智慧，为治疗心衰提供了独特见解和思路。黄连就是被历代医家广泛应用的一种传统中药材，其提取物小檗碱（Berberine,BBR）被临床工作者证实可以抑制心肌肥大，拮抗心室重构，减少心衰患者的死亡率、再住院率，在心衰治疗上具有潜力。但是小檗碱抑制心肌肥大的机制目前并不是很清楚。本研究探索了心肌细胞肥大状态下LncRNA-MIAT 与自噬通路蛋白腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及自噬标志蛋白LC3Ⅱ、P62 的表达水平，进而验证小檗碱抑制心肌细胞肥大是否与其调控LncRNA-MIAT 和自噬的能力有关。

表1 干扰片段基因序列

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞H9C2 购自中国科学院细胞库，盐酸小檗碱（批号A600129-0005）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ，批号A07852）均购自Sigam（上海）公司，DEME 培养基（批号C11875500BT）、胎牛血清（批号16000-044）、青链霉素混合液（批号15140-122）、0.25%的胰蛋白酶（批号25200-072）、一抗、二抗等主要试剂均购自碧云天生物科技有限公司，Trizol试剂（批号TR118-500）、RNA 试剂提取盒（批号Trizol）购自MRC（美国），逆转录试剂盒（批号M1705）、GoTaq® qPCR Master Mix（批号A6002）购自Promega（北京）；质粒及引物的设计和合成委托上海生工生物公司完成。

1.2 主要仪器

旋涡振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，vortex-5）、手提式高速分散器（宁波新芝生物科技有限公司，S10）、紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司，UV-752P）、移液枪（Eppendorf）、紫外透射分析仪（Hema,UV-3A）、电子天平（上海精密科学仪器有限公司，JA1003N）、冷冻高速离心机（Hema,TGL-16R）、基因扩增仪（Hema,Hema9600）、倒置显微镜（NIKON）。

1.3 方法

1.3.1 H9C2心肌细胞培养与心肌细胞肥大模型建立

将获得的H9C2 心肌细胞置于DEME 培养基进行培养，当细胞数达到80-90%时，吸取培养基。用PBS洗涤细胞2 次。再加入0.25%的胰蛋白酶溶液5 mL，并放于37℃培养箱2-3 min。用倒置显微镜观察细胞形态，若细胞将要分离并呈现圆粒状时，立即倒掉胰蛋白酶溶液，并加入适量含胎牛血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶溶液作用。用吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，补足培养基，按1∶2进行传代。最后放入37℃中的5% CO2培养箱培养。当细胞数达到80-90%且状态良好时，于-80℃的低温冰箱液氮罐冻存备用。将解冻后的H9C2 心肌细胞置于DMEM培养液（10%胎牛血清）中，培养48 h 后的H9C2 心肌细胞换无血清培养液饥饿12 h 后，用稀释后浓度为10-6mol·L-1的AngⅡ溶液干预诱导48 h，用倒置显微镜观察细胞形态及单位面积下心肌细胞数量，用图像分析软件image pro plus 6.0 分析计算心肌细胞平均表面积（μm2），面积计算公式为：细胞平均表面积=总面积÷细胞个数。

1.3.2 转染质粒干扰LncRNA-MIAT

细胞消化后，接种至24孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。第2 d 细胞密度为80%，吸去培养基。200 pmol 干扰片段溶于250μl opti-MEM 中，混匀、静置。将1.5 μl Lipofectamine 2 000 溶于250 μl opti-MEM 中，轻轻混匀，室温静置5 min。将片段和脂质体溶液混匀，室温静置20 min，滴加至6 孔板孔中，混匀，37℃、5% CO2培养箱中培养。4 h 后，吸去转染培养基，加入2 mL完全培养基，继续培养24 h后行qPCR检测和Western blotting检测。

1.3.3 qPCR检测LncRNA-MIAT的表达

用Trizol 提取心肌细胞的总RNA，然后用逆转录试剂盒将提取的总RNA 逆转录成cDNA，反应条件：70℃5 min，冰上5 min，42℃60 min。使 用GoTaq®qPCR Master Mix 将cDNA 扩增，反应条件：热变性95℃120 s 1 cycle，变性95℃15 s，退火延伸60℃30 s，40 cycle，溶解曲线60-95°C。所用引物序列为：MIAT,F 5'-GAGGGAAGTTCTGAGCTTGG-3'and R 5'-CCTTTCTTCTGGGCTGAGAC-3'，NCBI 序 号102 552664；LncRNA-CHRF，5'-CCUGCCUUGUAUUUUGUGUUG-3' and 3'-CAACACAAAATACAAGGCAGG-5'，NCBI

图1 不同浓度Ang度诱导H9C2心肌细胞肥大能力

序号105 463121；GAPDH：5'-GCAAGAGAGAGGCCCTCAG-3'and 5'-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3'。

1.3.4 Western blotting 检测自噬相关信号通路p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/GAPDH、P62/GAPDH蛋白表达

收集心肌细胞后，加入100 μl 裂解缓冲液，冰水浴置2 h，期间轻摇振荡。然后于4℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液。应用Bradford 法检测蛋白浓度。每孔上样50 μg，滴加SDS 缓冲液，加热至沸点约5 min，在通过含有10% SDS-聚丙烯酰胺的凝胶电泳而分离蛋白质，将分离的蛋白转印到NC 膜，并将Tris缓冲盐溶液冲脱脂奶粉稀释至5%浓度封闭液，在25℃下封闭2 h，再加入相应抗体（1∶700）于4℃孵育放置12 h，用Tris 缓冲盐溶液反复洗膜3 次，最后滴入相应过氧化物酶印记的羊抗兔IgG 二抗（1∶4 000），在25℃下放置1 h，重复上述洗膜过程3 次，每次10 min。组后用ECL 发光显色，使用凝胶成像仪进行拍摄、描绘并进行灰度分析。以目的蛋白与β光显色，使用的吸光度比值表示目的基因在蛋白水平的表达。

1.4 统计学处理

使用SPSS19软件进行统计学分析，计量资料用均数± 标准差（±s），多组间均数的比较采用One-way ANOVA分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管紧张素Ⅱ诱导H9C2 心肌细胞肥大能力与浓度正相关

用浓度梯度（0、10-8、10-7、10-6mol·L-1）的AngⅡ处理H9C2 心肌细胞，48 h 后用荧光显微镜观察免疫荧光染色下心肌细胞变化情况。结果如图1所示：AngⅡ处理的H9C2 心肌细胞的细胞核与表面积增大，且这种改变与AngⅡ的浓度有剂量相关性，以10-6mol·L-1浓度的AngⅡ诱导能力最强（故后续实验我们均采用10-6mol·L-1的AngⅡ诱导心肌细胞肥大）。

2.2 小檗碱逆转心肌细胞肥大具有浓度依赖性

用不同浓度（0.5、5、50 μmol·L-1）小檗碱处 理H9C2 心肌细胞肥大模型（浓度为10-6mol·L-1的AngⅡ诱导），48 h后荧光显微镜观察免疫荧光染色下心肌细胞变化情况。结果如图2 所示，随着小檗碱浓度的增加，心肌细胞核与表面积逐渐缩小。这证明小檗碱可以逆转心肌细胞肥大，且这种作用与小檗碱的浓度正相关。

2.3 H9C2 心肌细胞肥大模型LncRNA-MIAT 表达增加，小檗碱处理后LncRNA-MIAT的表达下调

为了增加实验的成功率，我们选择了两条目标LncRNA（LncRNA-MIAT、cardiac hypertrophy-related factor,LncRNA-CHRF），然后用qPCR 技术对心肌细胞进行检测。结果如图3、图4 所示：上述2 条lncRNA在肥大的心肌细胞中均出现过表达，与正常的H9C2心肌细胞相比，其LncRNA-MIAT、LncRNA-CHRF 数量差异具有统计学意义（均P＜0.01），因此，可认为LncRNA-MIAT、LncRNA-CHRF 可能是潜在的导致心肌细胞肥大的基因靶点。在用不同浓度（0.5、5、50 μmol·L-1）的小檗碱处理后，与心肌细胞肥大模型组相比，LncRNA-MIAT和LncRNA-CHRF的表达均出现有意义的下调（P＜0.05），且以LncRNA-MIAT 表达差异最为显著（P＜0.01），并且LncRNA-MIAT 的表达水平与小檗碱的给药浓度呈现负相关的关系（后续实验均使用50 μmol·L-1小檗碱）；因此，我们认为小檗碱通过下调LncRNA-MIAT 的表达是其抑制心肌细胞肥大的机制之一。

图2 不同浓度小檗碱逆转心肌细胞肥大能力

图3 lncRNA-MIAT表达情况

图4 lncRNA-CHRF表达情况

2.4 干扰LncRNA-MIAT后心肌细胞肥大出现逆转

进一步验证LncRNA-MIAT 与心肌细胞肥大的关系，用siRNA 技术干扰H9C2 心肌细胞肥大模型，免疫荧光染色后用荧光显微镜观察，结果如图5 所示：siModel 组与NC 组比较，心肌细胞细胞核与表面积均明显增大，而siMAIT 组与siModel 相比，心肌细胞细胞核与表面积明显缩小。这进一步证明了LncRNAMIAT 可以诱导心肌细胞肥大，干扰LncRNA-MIAT 功能后心肌细胞肥大可出现一定程度逆转。

2.5 沉默LncRNA-MIAT 后H9C2 心肌细胞自噬活性增加

用Western blot 检测自噬通路相关蛋白p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH、P62/GAPDH 比率。结果如图6所 示：siModel 组 与BBR 组比较，p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH 比值缩小，P62/GAPDH 比值增大，提示心肌肥大时自噬活性减弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）；图C 中，siRNA-MIAT 组与BBR 组比较，siRNAMIAT 组P62/GAPDH 比值下调（P＜0.05），与siModel组比较，siRNA-MIAT 组P62/GAPDH 比值显著下调（P＜0.01），均具有统计学差异。在图D、E 中，siRNAMIAT 组与BBR 组及siModel 组比较，质粒siRNAMIAT 转染后p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH 比值出现显著上调，差异具有统计学意义（均P＜0.01）。qPCR技术检测LncRNA-MIAT 表达水平，结果如B 所示：siRNA-MIAT 组 及BBR 组与siModel 组比较LncRNAMIAT表达量明显下调（P＜0.01）。这提示心肌细胞肥大时细胞自噬活性减弱，下调LncRNA-MIAT 能改变AMPK、LC3Ⅱ、P62的活性增强AngⅡ诱导的心肌肥大细胞自噬，小檗碱抑制心肌细胞肥大的机制可能是其通过下调LncRNA-MIAT 的表达增强自噬活性实现的。

图5 siRNA技术干扰后的心肌细胞肥大情况

图6 Western blot检测p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/GAPDH表达水平

图7 AngⅡ模拟的压力信号上调了LncRNA-MIAT表达，作用于AMPK、LC3II、P62，使细胞自噬下降，心肌细胞的细胞核与表面积增大；小檗碱在压力负荷增加情况下，通过下调Ln⁃cRNA-MIAT，使AMPK、LC3II活性增加，P62活性降低，进而使心肌细胞自噬增强，心肌细胞的细胞核和表面积缩小。

3 讨论

心肌肥大是心肌细胞在外界刺激下所做出的代偿反射，当这种代偿到了一定阶段，心脏就会出现结构与功能的改变，表现为心室重塑和心功能下降，因此深入去探讨心肌肥大的病理机制与基因靶点，研究和开发抑制心肌肥大的新药物与治疗手段，对于心衰防治具有重要意义。人们对心衰治疗的探索几经波折，目前的治疗旨在改善衰竭心脏的生物学特性，应用血管紧张素转化酶抑制剂、β受体阻滞剂等在内的神经内分泌抑制剂拮抗心室重构，以降低心衰的病死率和住院率[8]。当前一种新药沙库巴曲/缬沙坦（血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂）被欧洲心脏病协会及加拿大心血管病协会新指南推荐用于心衰治疗，在降低心衰死亡和住院风险方面，被认为有优于依那普利的治疗效果，给心衰治疗带来新希望，但是其长期使用的安全性和疗效的稳定性仍然需要临床实践的检验[9,10]。而中医药经过长期临床积累，发现部分方药确能治疗心力衰竭，展现出了价廉效优、毒副作用小的独特优势。其中一种归属于毛茛目的草本植物，其根茎入药就是传统中药黄连，具有清利湿热，泻火解毒的功效，通过不同炮制方法，黄连功效侧重点不同，酒制善清上焦火热，姜制善清胃止呕，萸制则舒肝和胃。《本草经解》谓其：味苦无毒，得地南方之火味，入手少阴心经，气味俱降，阴也。所以善清心火，治心病[11]。药理学研究发现其治病的主要成分就是小檗碱。小檗碱具有抑菌、抗血小板、降糖、降压、拮抗心室重构、保护心肌等多种作用[12,13]，有研究发现小檗碱对于正常的H9C2 心肌细胞无影响，但在缺氧复氧诱导的H9C2 心肌细胞中，细胞的活力随着小檗碱的给药剂量的增加而增加[14]。我们的研究用不同浓度的小檗碱处理H9C2心肌细胞，发现小檗碱可以逆转AngⅡ诱导的细胞肥大，且小檗碱抑制心肌细胞肥大的作用具有浓度依耐性的特点。

LncRNA 是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，具有调节基因转录、促进转录因子激活等多种生物学功能。近年来，LncRNA 与心衰的关系是临床研究热点。其在心衰应用中的巨大潜力在于：它一方面可能成为一种高敏感、高特异性检测心衰的生物学标志。例如，有学者检测了心衰小鼠的心脏、血浆及全血中LncRNA 的变化,发现有32 组LncRNA 存在特征性表达,并认为LncRNA 可能成为心衰的潜在生物标志物[15]。另一方面，LncRNA 在分子水平上有着强大的调控力，可以调控细胞的稳态并进一步影响疾病发展，其作为药物靶点的临床运用潜力巨大。Viereck J 在小鼠心衰模型与主动脉狭窄所致的心衰患者中均发现LncRNA-Chast 显著表达，在沉默Chast后,小鼠心室重构情况得到改善[4]。Tao H 等人的研究发现LncRNA 在包括心肌纤维化等多种疾病中表达，通过上调LncRNA-GAS5 可以负向调控miR-21 的表达，从而抑制心肌纤维化，改善心室重构[16]。我们的研究通过qPCR 技术证实了LncRNA-MIAT 在肥大的心肌细胞模型中表达增加，用siRNA 技术干扰LncRNAMIAT 后，发现心肌细胞肥大出现逆转，证明其能诱导心肌细胞肥大。进一步研究用小檗碱处理肥大的心肌细胞，发现LncRNA-MIAT 表达下调，心肌细胞肥大情况改善，这表明小檗碱可以通过下调LncRNAMIAT的表达抑制心肌细胞肥大。

自噬是细胞器及细胞内容物利用溶酶体被降解过程的统称，生理状态下，细胞自噬处于较低水平，其目的在于清除衰老受损的细胞器；在病理状态下，自噬会显著激活，在稳定细胞形态及结构，维持细胞正常生理功能方面起着重要作用。自噬水平的调节受自噬基因和蛋白的控制，AMPK 是生物能量代谢的关键调节激酶，LC3Ⅱ是哺乳动物细胞自噬的标记蛋白之一，其可以通过泛素样修饰作用定位于自噬小体中，其含量的高低与自噬水平呈正相关关系[17]。研究发现AMPK 激活促进了下游自噬标志蛋白LC3Ⅱ的激活，使心肌细胞逐渐适应慢性缺氧等病理状态[18-19]。P62 是LC3 下游的结合蛋白，可以看做是自噬的降解底物，其含量高低与自噬水平负相关[20]。心肌肥大与自噬关系密切,经敲除自噬相关基因Atg5和Atg7,在血管紧张素Ⅱ和异丙肾上腺素诱导的压力超负荷动物模型中，自噬受到抑制，明显加速心肌肥大及心衰的进程[21-22]。我们对比了心肌细胞肥大模型和用小檗碱、干扰质粒siRNA-MIAT 处理的心肌细胞肥大模型中自噬通路的标志蛋白表达情况，发现与对照组相比，经小檗碱、干扰质粒siRNA-MIAT 处理的模型组的p-AMPK/AMPK、LC3II/GAPDH 比值增加，P62/GAPDH比值下降，这表明LncRNA-MIAT 使AMPK、LC3Ⅱ的活性下降，P62 活性增加，进而使心肌细胞自噬减弱，这种作用经沉默LncRNA-MIAT 或使用小檗碱干预后出现一定程度逆转,表明小檗碱抑制心肌细胞肥大的作用，可能是其通过下调LncRNA-MIAT 的表达,使AMPK、LC3Ⅱ活性增加、P62 活性下降而促进心肌细胞自噬实现的。这种机制总结如图7。

综上所述，我们初步探明了小檗碱/LncRNAMIAT/AMPK/LC3Ⅱ/P62/心肌细胞肥大之间的关系。因此我们认为小檗碱下调LncRNA-MIAT 的表达水平抑制心肌细胞肥大，与其增加AMPK、LC3Ⅱ的活性，减弱P62 活性,进而促进心肌细胞自噬逆转心肌肥大，这可能是小檗碱治疗心衰有效的主要机制之一，对中医探索新的方法治疗心衰具有重要意义。然而多种LncRNA 与心肌肥大存在关系，自噬过程也受多个基因调控。但是限于条件与经费所限，我们并没有深入去挖掘是否存在其它LncRNA 在小檗碱抑制心肌肥大的过程中出现有意义的表达，也没有进一步探讨更多的自噬基因与这些LncRNA 的关系。下一步的实验我们将对其做进一步探讨。