凡纳滨对虾养殖亲本群体遗传多样性分析

陈锦豪，郑锦滨，王攀攀，李天骄，毛 勇，2*，苏永全，王 军

(1.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361102； 2.厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室，福建 厦门 361102)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，亦称南美白对虾、太平洋白对虾，原产于中、南美的秘鲁北部至墨西哥太平洋沿岸，但在厄瓜多尔沿岸分布尤为集中[1]。凡纳滨对虾是一种热带虾，具有生长快、抗病力强、适应性强、壳薄肉嫩，味道鲜美等特点，在对虾业养殖中占有重要地位，在我国南北方沿海地区广泛养殖[2]。但近年来，一方面养殖环境不断恶化，对虾病害频繁暴发；另一方面随着养殖规模的扩大，对虾亲本来源选择过于盲目，甚至从养殖池里直接选用，造成对虾群体遗传多样性降低、近交衰退等，导致对虾生产降低，严重影响今后对虾优良种质的保护和利用以及生产的发展[3-6]。

微卫星(Microsatellite)，亦称简单序列重复(Simple sequence repeat，SSR)、短串联重复(Short tandem repeat，STR)，是指以1～6个碱基为重复核心的串联重复DNA序列，分布于生物体的整个基因组[7-8]。作为迅速发展的DNA分子标记技术之一，微卫星具有数量多、多态性丰富、重复性好、易操作、呈共显性遗传、在真核生物基因组中分布的随机性等特点，故其已被广泛应用于对虾群体遗传学方面的研究[9-13]。

厦门对虾种苗产业链因独特的地理位置、便捷的交通、对台合作的先天优势而聚集了技术、资金和市场等要素。据数据资料显示，2014年厦门海洋经济占据了全市GDP总值的1/8，总产值2045.9亿元，同比增长10.2%，其中，厦门市对虾种苗产业在厦门乃至福建省的海洋产业中占据重要的地位，特别是厦门市凡纳滨对虾种苗产业。作为我国虾苗的集约地，厦门市翔安区拥有数百个对虾种苗场，出产着全国近40%的虾苗，也曾一度占据我国对虾年育苗量的60%以上，至今依然在全国对虾产业链的种苗环节中占据着不可替代的重要地位。

然而，随着对虾市场需求量的增大，种苗培育技术也随之变化。一方面，高温、高密度、高抗生素的“三高”养殖模式成为普遍形式，这就导致虾苗繁育过程中经常出现营养不均衡、养殖环境恶化、病害暴发频繁等问题；另一方面，在集约化苗种培育技术已达峰值的背景下，有些育苗场为了进一步降低成本，对种虾不经选育，长期近交。近交衰退的潜在风险导致虾苗出现生长缓慢、参差不齐、抵抗力差等现象，直接影响了种苗质量和健康。为了解析厦门市凡纳滨对虾“土苗”(大多经养殖的商品成虾、经筛选以备作亲本所产生的子一代苗种)亲虾群体的遗传背景，了解“土苗”种质资源现状，明确近交程度，本研究运用微卫星技术，选用8对多态性较好的微卫星引物，分别对从厦门市5个对虾育苗场选取5个来源的凡纳滨对虾“土苗”亲虾群体的遗传多样性进行分析比较，从分子水平上了解其遗传背景，为该地区凡纳滨对虾种质资源的提纯、保优、复壮及遗传选育提供背景资料和建议。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究考察了厦门市凡纳滨对虾传统育苗模式下的亲本来源，所选定的5个凡纳滨对虾的亲本分别来自于诏安、海南、漳浦、东山等地的对虾养殖池。由于这些传统育苗场没有规范的苗种生产记录，也无明晰的选育技术路线，亲本来源普遍存在种源不明、种质混杂等情况，本文通过调查走访了解到育苗场亲虾的采集地、亲本来源等信息(表1)。5个凡纳滨对虾亲虾群体样品分别于2016年11月—2017年3月期间采自福建厦门翔安区不同育苗场，每个群体30尾[体重(122.05±13.70)mm、体长(21.8±8.62)g]，编号ZhaoAn1、HaiNan、ZhaoAn2、ZhangPu、DongShan(ZA1、HN、ZA2、ZP、DS)。样品运送到实验室后，用剪刀取对虾背部肌肉置于无水乙醇中，-20℃保存待用。

表1 凡纳滨对虾亲虾采集地及亲本来源

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

实验采用异硫氰酸胍法提取凡纳滨对虾基因组DNA[14]，使用1%的琼脂糖凝胶电泳与Q5000超微量紫外分光光度计(美国Quawell)进行基因组DNA质量及浓度的检测。

1.2.2 微卫星引物筛选

选用8对多态性较高、特异性强且重复性好的微卫星引物[15-16](表2)进行等位基因的扩增，在引物5’末端设计添加不同类型的特异性荧光标记(FAM或ROX)，荧光标记引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 凡纳滨对虾8对微卫星引物信息

1.2.3 PCR反应体系

PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTPs(2.5 μM)1.6 μL、正向引物(10 μM)0.5 μL、反向引物(10 μM)0.5 μL、模板DNA(100～120 ng/μL)1 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL、灭菌的去离子水(ddH2O)18.6 μL。反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，(57±6)℃ 30 s，72℃ 45 s，循环 30次，72℃ 10 min，16℃ 90 min。使用1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将片段大小与预测相一致的PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行简单重复序列(SSR)分型分析。

1.3 数据处理与分析

等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)由PopGene3.2软件计算完成。根据等位基因的频率，运用PIC_CALC0.6软件计算各群体各位点的多态信息含量(PIC)。利用Arlequin3.5进行近交系数(Fis)、Harde-Weinberg(H-W)平衡检验(P值)、分子变异分析(AMOVA)、遗传分化指数(Fst)以及基于Fst的Slatkin’s遗传距离的计算。运用MEGA4.0软件，根据5个凡纳滨对虾群体间的遗传距离，构建UPGMA聚类图。

2 结果

2.1 群体遗传多样性分析

本实验中所用的8对微卫星引物在5个凡纳滨对虾亲虾群体中共检测到75个等位基因，8个位点平均等位基因数(Na)为9.375，其中，位点TUMXLv7.56最多，共有25个，TUMXLv8.176最少，仅有3个(表3)；5个群体在8个微卫星位点上的平均等位基因数(Na)为3.875～7.000，其中ZA1群体最低(3.875)，HN群体和ZP群体最高(7.000)；平均有效等位基因数(Ne)为2.632～3.719，其中ZA1群体最低(2.632)，HN群体最高(3.719)(表4)。

在5个群体中，8个位点的PIC值在0.450～0.918之间，平均PIC值为0.639，其中最高为TUMXLv7.56(0.918)，最低为TUMXLv8.176(0.450)(表3)；在5个群体中，各群体的平均PIC值范围在0.498～0.624，其中ZA2群体最高(0.624)，ZA1群体最低(0.498)；除位点TUMXLv10.312在DS群体中的PIC值低于0.250，其余位点的PIC值均大于0.250(0.280～0.913)(表4)。

5个群体的平均观测杂合度(Ho)为0.410～0.562，其中ZA1群体最低(0.410)，ZA2群体最高(0.562)；平均期望杂合度(He)为0.589～0.687，其中DS群体最低(0.589)，ZA2群体最高(0.687)(表4)。平均观测杂合度均比平均期望杂合度要小，表明各群体中普遍存在着杂合子缺失的情况。各群体的平均近交系数(Fis)均为正值(0.147～0.305)(表4)，且除位点TUMXLv10.255外，其余7个位点平均近交系数(Fis)均为正值(表3)，说明5个凡纳滨对虾群体近交程度较高，杂合子缺失较为严重。

通过对5个群体8个位点上的H-W平衡遗传检测，发现40个数据(5个群体×8个位点)中只有14个符合H-W平衡(P>0.05)，有26个位点由于不同程度的杂合子缺失(Fis>0)导致不符合H-W平衡(P<0.05)；在5个群体中，除ZP、DS群体外，群体ZA1、HN、ZA2在多个位点上都显著偏离H-W平衡(P<0.05)(表4)。

表3 8对微卫星位点在5个凡纳滨对虾亲本群体上的遗传特性

表4 5个凡纳滨对虾亲本群体在8对微卫星位点上的遗传特性

续表4

续表4

注：*为显著偏离H-W平衡，P<0.05；**为极显著偏离H-W平衡，P<0.01。

Notes：*was significant deviation from H-W balance，P<0.05；**was significantly deviated from H-W balance，P<0.01.

2.2 群体遗传变异与聚类分析

对5个凡纳滨对虾群体间遗传分化水平进行检测，各群体间的遗传分化指数(Fst)在0.028～0.199之间(表5)。分析表明，ZA2群体和ZP群体间的Fst最小(0.028)，群体遗传分化最弱；ZA1群体和DS群体间的Fst最大(0.199)，遗传分化最显著；除ZA2群体与ZP群体，HN群体与ZA2群体属于轻度遗传分化(0

表5 5个凡纳滨对虾亲本群体间的遗传分化指数Fst

对5个凡纳滨对虾亲虾群体的AMOVA分析显示，只有10.65%的遗传变异来自于群体间，而89.35%的遗传变异来自于群体内，表明群体内的遗传变异贡献率要明显大于群体间(表6)。

表6 5个凡纳滨对虾亲本群体分子变异(AMOVA)分析

基于群体间遗传分化指数计算5个凡纳滨对虾亲虾群体间的Slatkin’s遗传距离(表7)，结果显示各群体间的遗传距离在0.029～0.249之间，其中，ZA2群体和ZP群体的遗传距离最小(0.029)，ZA1群体和DS群体间的遗传距离最大(0.249)。根据遗传距离进行的UPGMA聚类分析结果表明(图1)，DS群体与其余4个群体亲缘关系均较远，ZA2群体与ZP群体亲缘关系最近，它们首先聚为一支，接着分别再与HN群体、ZA1群体、DS群体聚为一支。

表7 5个凡纳滨对虾亲本群体Slatkin’s遗传距离

3 讨论

3.1 凡纳滨对虾群体的遗传多样性

多态信息含量(PIC)是表示微卫星DNA变异程度高低的一个指标。根据Botstein等[17]首先提出的PIC划分规则，本实验中五个群体的平均PIC在0.498～0.624之间，除了位点TUMXLv10.312在DS群体上表现出低度多态性(PIC<0.25)，其余位点均属中度或高度多态性(PIC>0.25)，所以仅从PIC值来看，这五个群体的遗传多样性较高。根据Barker[18]的报道，微卫星位点含有4个或4个以上的等位基因对于物种的遗传进化具有一定程度的贡献。本实验中8个微卫星位点上的等位基因数在3～25个，与Tassanakajon等[19]结果相似。其中有7个位点的等位基因数为4个或4个以上，表明用这几个位点对凡纳滨对虾进行微卫星标记遗传多样性分析效果较好。但各位点有效等位基因数在2.034～13.010之间，除位点TUMXLv7.56有效等位基因数最高外(13.010)，其余位点有效等位基因数均小于5，可能是由于部分位点存在较多的无效等位基因从而高估了PIC值，造成群体遗传多样性水平虚高。

H-W平衡检验结果表明，除了ZP群体与DS群体有5个位点符合H-W遗传平衡外，其余几个群体都有至少6个位点显著偏离平衡(P<0.05)，在总共40个数据中(5个群体×8个位点)，共有26个偏离了H-W遗传平衡，说明绝大部分群体都存在着不同程度杂合子缺失的情况。可能是由于无效等位基因的存在[20]以及凡纳滨对虾亲本选择过于盲目，并且后代长期近交，从而导致个体间近亲交配率逐渐提高，造成群体杂合子缺失严重，群体遗传结构已经较为脆弱。

统计分析结果显示，5个凡纳滨对虾群体的平均Ho和平均He分别在0.410～0.562和0.589～0.687之间，ZA1群体在TUMXLv7.97位点上的Ho为0，表明ZA1群体在该位点上的等位基因几乎都为纯合子，且除位点TUMXLv10.255外，其余位点观测杂合度均小于期望杂合度，表明这5个群体普遍存在着杂合子缺失的现象，这与Jimenez等[21]关于太平洋凡纳滨对虾群体遗传结构的研究结果一致，杂合子缺失现象在Xu等[22]与Supungul等[23]对斑节对虾(Penaeusmonodon)的研究中也有发现。杨锐等[24]研究发现，杂合子缺失将导致纯合子增加，提高有害等位基因纯合的几率，近交衰退几率升高，从而降低物种对环境变化的适应性。本研究结果显示，除位点TUMXLv10.255(Fis=-0.497)外，其余位点的平均Fis均为正值，这与童馨等[25]所研究的凡纳滨对虾养殖群体(-0.166

3.2 凡纳滨对虾群体间的遗传差异

遗传分化指数(Fst)是衡量群体间遗传分化程度的重要指标，其划分规则为0～0.05表示群体间分化较弱，0.05～0.15表示分化中等，0.15～0.25表示分化大，大于0.25表示分化极大[28]。本实验中5个凡纳滨对虾群体间的遗传分化指数(Fst)在0.028～0.199之间。分析结果表明，除了HN群体与ZA2群体(Fst=0.047)、ZA2群体与ZP群体(Fst=0.028)间的遗传分化较弱(0

群体间的遗传关系一般以基于通过等位基因频率计算而得的遗传距离来体现。Crawford等[29]认为由微卫星计算得出的遗传距离更能反映种群分化时间的长短，能客观地反映群体间的遗传和分化。分析本研究中基于Fst的各群体间Slatkin’s遗传距离，结果显示，各群体间的遗传距离在0.029～0.249之间，表明5个群体之间的遗传差异较小。这提示在凡纳滨对虾苗种培育中，亲本的选择需要考虑遗传距离这一指标，它反映的是不同品种进化上的关系；选择遗传距离大且性状良好的群体进行杂交育种，发挥杂种优势，有利于种质的提高以及后代各种优良性状的产生与新品种的培育[30]，进而推动凡纳滨对虾养殖产业的发展。

4 结论

由于市场需求增大而导致的苗种培育方式的改变以及苗种培育企业普遍缺少对虾育种技术的专业指导，使得厦门市凡纳滨对虾亲虾群体近亲交配严重，近交衰退现象明显。经过多代的近亲交配后，有害等位基因纯合比例不断升高，加上养殖过程中大量抗生素的使用，使得虾苗普遍较为脆弱，造成对虾种苗品质下降，严重阻碍了凡纳滨对虾养殖产业的发展。同时，由于我国的优良亲虾基本被国外进口的种虾垄断，导致厦门市庞大的对虾种苗产业链因缺少稳定的种源供应造成无序发展乱象，而且种源混杂现象十分突出，国内外的种质、一代二代的虾苗、优劣种齐聚厦门，良莠不齐、掺假现象也时有发生。因此在生产中应明确对虾种质来源，科学规范苗种培育流程，国内各苗种培育企业和相关科研单位可进行联合杂交育种，选用性状良好的亲本个体，利用杂交优势，改善后代的遗传多样性水平，提高后代优良经济性状的比例，这对于厦门市对虾新品种的培育乃至国内凡纳滨对虾种苗产业的发展具有重要意义。