枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病抑菌作用及防治效果

姚凤琴 ，林发壮，陈昌铭，林辉锋，夏朝水，钟琳珊

(三明市农业科学研究院， 福建 三明 365509)

非洲菊Gerberajamesonii，又名扶郎花、太阳花等，是菊科大丁草属多年生宿根草本花卉。非洲菊是世界五大鲜切花之一，原产于南非，现已全球化规模种植[1]。由于非洲菊受周年种植及固定栽培设施的限制，使非洲菊根腐病发病率逐年上升，尤其是春夏季的高温高湿更能加快有害病原菌的增殖和传播，是根腐病高发期，一般发病率为20%～30%，严重时高达80%，已成为制约我国非洲菊产业可持续发展的重要因素[2]。

目前针对非洲菊根腐病的防治主要以物理清除和化学药剂喷施为主，而使用化学农药不仅带来日趋严重的农药残留、环境污染等问题，还加速病原菌耐药性的产生，加重了防治难度，提高了种植成本。近年来，随着人们对绿色土地、生态环境修复的日益重视，利用有益微生物防治植物土传病害已成为当前研究的热点。枯草芽孢杆菌是一种理想的生防微生物，已在棉花、番茄、辣椒、小麦、茄子、玉米、水稻、甜瓜、马铃薯、黄瓜等不同作物病害上得以成功应用，并取得了良好的成效[3-12]。目前，枯草芽孢杆菌在非洲菊根腐病上应用的研究还很少。本研究就枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病菌的抑制作用及温室盆栽防效进行了探讨，以期为开发一种有效防治非洲菊根腐病的生防菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

非洲菊根腐病病原菌菌株：隐地疫霉菌Phytophthoracryptogea、腐皮镰刀菌Fusariumsolani分别从三明市农业科学院非洲菊种植基地的根腐病病株分离、鉴定获得，分离方法参照谢为龙等[13]的方法；枯草芽孢杆菌Bv17由中国农业科学院农产品加工研究所加工有害生物防控创新团队提供。

1.2 试验方法

1.2.1枯草芽孢杆菌Bv17菌液的制备 活化枯草芽孢杆菌Bv17菌株，然后从该菌株的菌落边缘挑取直径为5 mm的菌块接种于LB固体培养基上，并置于30℃培养箱内暗培养5 d；之后，挑取LB固体培养基上的菌落边缘直径为5 mm的菌块2块，置于LB液体培养基内，在30℃、200 r·min-1的摇床内培养2 d；然后在5 000 r·min-1的条件下离心10 min后，倒掉上清液，加水稀释菌体获得浓度为5×106cfu·mL-1的枯草芽孢杆菌Bv17菌液备用。

1.2.2枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病菌抑制作用的测定 试验采用杯碟法，参照文献[4]进行。处理组(BS)：将枯草芽孢杆菌Bv17菌液按1∶100的比例加入35～40℃的PDA培养基中，摇匀后倒入培养皿(φ9 cm)中，冷凝后分别接种直径为0.8 cm的致病菌(隐地疫霉菌、腐皮镰刀菌)菌碟，分别做3次重复，置于30℃下培养；以不添加枯草芽孢杆菌Bv17菌液的PDA培养基为空白对照组(CK)。培养2 d 后开始观察测定菌落直径，抑菌率计算抑菌率，公式如下。

抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]× 100%

1.2.3枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病防效试验 处理1～4分别为枯草芽孢杆菌Bv17菌液浓度5×104、5×105、5×106、5×107cfu·mL-1处理，在枯草芽孢杆菌Bv17菌液中加细壤黄心土(经孔径4 mm园艺筛过筛)调成稀泥浆，其中枯草芽孢杆菌Bv17菌液和黄心土的配比为4∶1。将生长良好的云南红非洲菊穴盘苗拔出穴盘，并把其根系全部放进枯草芽孢杆菌Bv17泥浆中1～2 min，稍转动该穴盘苗至泥浆蘸均后取出，之后再将该穴盘苗定植至装有腐殖质的花盆中。以蘸清水泥浆的为对照组(CK)，每个处理各30株，试验重复3次，置于(25±2)℃的温室内培养，光照强度为(1 500±200)lx，光照时间为12 h·d-1。

非洲菊种苗定植1个月后，用隐地疫霉菌发酵液(浓度为3×106cfu·mL-1)和腐皮镰刀菌发酵液(浓度为3×106cfu·mL-1)1∶1配比混合液进行灌根处理，每株25 mL，从处理后第3 d开始观察统计发病情况。按发病率及病情指数记录发病情况，病情分级标准参照李越等的方法[14]。

病情分级标准：0级-无病；1级-1/2以下叶片萎蔫；2级-1/2以上叶片萎蔫，但未完全萎蔫；3级-全部叶片均萎蔫，有的叶片开始干枯；4级-全株枯死。

病情指数 = 100×∑(各级病株数×相对级数) /(调查总株数×发病最重级数)

相对防效 = (对照组病情指数-处理组病情指数) /对照区病情指数×100%

发病率 = 发病株数/调查总株数×100%

1.3 数据统计与分析

试验数据采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病病菌的抑菌效果

杯碟法测定结果(表1～2、图1)表明，培养初期，BS处理组与对照组隐地疫霉菌菌落均为圆形放射状向外扩展，且有气生菌丝；培养至第4 d时，BS处理组隐地疫霉菌菌落已停止向四周扩展，平均直径为2.21 cm，气生菌丝逐渐消失，外边缘菌丝逐渐变褐，而对照组隐地疫霉菌菌落直径已达5.78 cm，且持续圆形放射状向外扩展；培养至第6 d时，BS处理组隐地疫霉菌菌落气生菌丝消失，菌落萎缩，菌落周边有明显的褐色带，菌落直径为2.07 cm，而对照组隐地疫霉菌菌落直径已达7.85 cm，抑菌率达73.63%。培养初期，BS处理组腐皮镰刀菌菌丝有少许向上蓬松生长，但基本不向四周扩展，对照组腐皮镰刀菌菌丝圆形放射状向外扩展，且有气生菌丝；培养至第4 d时，BS处理组腐皮镰刀菌菌丝向上蓬松生长，但不向四周扩展，菌落直径只有1.21cm，而对照组腐皮镰刀菌菌落直径已达4.15 cm，且持续圆形放射状向外扩展；培养至第 6 d时，BS处理组腐皮镰刀菌菌落直径为1.21 cm，对照组腐皮镰刀菌菌落直径为8.31 cm，抑菌率达85.44%(图2)。综上表明，枯草芽孢杆菌Bv17菌液对非洲菊根腐病两种病原菌隐地疫霉菌和腐皮镰刀菌均有较好的抑制效果。

表1枯草芽孢杆菌Bv17对隐地疫霉菌的抑菌效果

Table1AntibacterialeffectofBacillussubtilisBv17onPhytophthoracryptogea

培养时间菌落直径(cm)CKBS抑菌率(%)第2 d2.26±0.132.03±0.1310.18第3 d3.87±0.112.21±0.0842.89第4 d5.78±0.142.21±0.0861.76第6 d7.85±0.172.07±0.0973.63

注：表中BS为添加枯草芽孢杆菌Bv17菌液处理组，CK为不添加枯草芽孢杆菌Bv17菌液；表2同。

表2枯草芽孢杆菌对腐皮镰刀菌的抑菌效果

Table 2 Antibacterial effect ofBacillussubtilisonFusariumsolani

培养时间菌落直径(cm)CKBS抑菌率(%)第2 d1.43±0.090.91±0.0236.36第3 d2.52±0.121.21±0.0551.98第4 d4.15±0.111.21±0.0570.84第6 d8.31±0.141.21±0.0585.44

图1 枯草芽孢杆菌Bv17对隐地疫霉菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Bacillus subtilis Bv17 on Phytophthora cryptogea注：图中A为不添加枯草芽孢杆菌Bv17菌液对照组，B为添加枯草芽孢杆菌Bv17菌液处理组；图2同。

图2 枯草芽孢杆菌Bv17对腐皮镰刀菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Bacillus subtilis Bv17 on Fusarium solani

2.2 枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病的防治效果

枯草芽孢杆菌Bv17处理组非洲菊种苗基本健康生长(图3A)；对照组大部分植株叶片第6 d开始出现轻微失水，根部有轻微的黏着感，于第10 d时，植株发生整株性萎蔫，根茎部变黑褐色、变软、水渍状、皮层腐烂脱落，植株开始逐渐干枯死亡(图3B)。病原菌灌根后15 d发病情况统计列于表2。从表2可以看出，在室内盆栽试验中，不同浓度处理的枯草芽孢杆菌Bv17均可大幅度地降低非洲菊根腐病的病情指数，具有良好的防治效果，不同浓度处理间防治效果差异达显著水平，防治效果随着枯草芽孢杆菌Bv17浓度的增加而提高。在供试浓度范围内枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病的相对防效均达70%以上，而浓度为5×107cfu·mL-1时防治效果最好，病情指数为2.50，相对防效高达97.32%。

表3枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病的防治效果

Table3ControleffectofBacillussubtilisBv17onrootrotofGerberajamesonii

处理发病率(%)病情指数相对防效(%)5(CK)100.0093.33-133.3327.5070.52±2.53 a223.3316.6782.14±3.55 b316.678.8990.45±2.88 c46.672.5097.32±1.56 d

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

图3 枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病的防治效果Fig.3 Control effect of Bacillus subtilis Bv17 on root rot of Gerbera jamesonii 注：A为枯草芽孢杆菌Bv17泥浆蘸根的非洲菊，B为清水泥浆蘸根的非洲菊。

3 结论与讨论

在土传病害发生的根际土壤环境中，不仅存在病原菌，还存在大量的拮抗菌，利用拮抗菌防治植物土传病害已成为当前研究的热点，具有广阔的的应用前景[15]。枯草芽孢杆菌抑菌谱广、分布广、生长快、营养简单，并对多种植物土传病害具有良好的防病效果，是目前植保研究者研究最多的生防细菌之一[16]。枯草芽孢杆菌既可产生细菌素类、酶类、活性蛋白质类、脂肽类、多肽类等多种抑菌物质抑制病原菌的生长；又可诱导植物自身抗病机制，进而提高植物自身免疫能力，增强植物的抗病性能[17]。

非洲菊根腐病主要是由隐地疫霉菌和腐皮镰刀菌引起的一种真菌性土传病害，长期以来主要使用化学农药防治，不仅防治效果不理想还会造成环境污染，生物防治既高效又绿色环保，是当前研究的热点，因此研究开发一种能够有效防治非洲菊根腐病的生物菌剂，对非洲菊产业的可持续健康发展具有非常重要的现实意义。侯彩霞等[18]研究发现枯草芽孢杆菌可使瓜果腐霉菌菌丝体发生解体、菌丝细胞发生扭曲、原生质浓缩，可有效防治加工番茄根腐病。赵长龙等[19]也发现枯草芽孢杆菌对菜豆根腐病菌腐皮镰孢菌丝的生长、孢子的产生和萌发等都能产生有效的抑制作用。本试验利用杯碟法研究了枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病菌的抑制作用，结果表明枯草芽孢杆菌Bv17对两种病原菌隐地疫霉素和腐皮镰刀菌均有明显的抑制效果，抑制率均在70%以上。但枯草芽孢杆菌Bv17对隐地疫霉菌、腐皮镰刀菌两种病原菌的作用机制不同，枯草芽孢杆菌Bv17在生长过程中可能产生了某种物质使隐地疫霉菌气生菌丝消失，菌落萎缩，菌落周边产生明显的褐色带；而对于腐皮镰刀菌，枯草芽孢杆菌Bv17则是一直抑制其菌落向四周扩展生长。因此枯草芽孢杆菌Bv17对非洲菊根腐病病菌的作用机制，还需要进一步探索研究。

室内盆栽防效试验结果表明枯草芽孢杆菌Bv17菌液对非洲菊根腐病具有较好的防治效果，防效高达97.32%。本研究是在实验室和温室可调控条件下进行，而关于在错综复杂的室外环境条件下生防菌剂的效果是否稳定还有待于下一步研究。