Bax在普萘洛尔诱导人血管瘤内皮细胞凋亡中的作用

姚天华　KrishnaRegmi　杜婧婷

[摘要]目的：通過不同浓度的普萘洛尔干预体外培养的血管瘤内皮细胞，探讨Bax基因在普萘洛尔诱导血管瘤内皮细胞凋亡中的作用。方法：体外培养人增殖期血管瘤内皮细胞，分别加入不同浓度的普萘洛尔药物干预，选择适宜的研究浓度及观察时间。构建Bax基因高表达及低表达组，检测其表达差异对于血管瘤内皮细胞凋亡的影响。结果：经普萘洛尔干预后细胞呈凋亡形态学改变，且随着药物浓度和药物作用时间的增加，细胞凋亡率也相应增加，其中300μmol/L的普萘洛尔干预24h时细胞凋亡率为28.49%，此为本实验中普萘洛尔诱导血管瘤内皮细胞凋亡的最佳药物浓度和时间点。Bax高表达组细胞构建成功后，经普萘洛尔干预，BAM7+普萘洛尔组>DMSO+普萘洛尔组>普萘洛尔组>BAM7组>空白对照组。Bax低表达组构建成功后，经普萘洛尔干预，Bax siRNA+普萘洛尔组>N.C siRNA+普萘洛尔组>转染试剂+普萘洛尔组>普萘洛尔组>空白对照组。结论：300μmol/L的普萘洛尔干预24h，是普萘洛尔诱导血管瘤内皮细胞凋亡的最佳药物浓度和时间点。Bax与普萘洛尔诱导血管瘤内皮细胞凋亡密切相关，Bax表达量越高，普萘洛尔诱导血管瘤内皮细胞凋亡的能力越强，Bax表达量降低，血管瘤内皮细胞凋亡无明显变化。

[关键词]普萘洛尔；血管瘤；凋亡；Bax；BAM7；siRNA

[中图分类号]R732.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）01-0100-05

The Effect of Bax on Propranolo Induced Hemangioma Endothelial Cell Apoptosis

YAO Tian-hua1，2，KRISHNA Regmi1，3，DU Jing-ting4，SHI Jing-yi1，3，HU Xiao-yi1，3，LI Li-feng1，3，TU Jun-bo1，3

（1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research；2.Department of General Dentistry；3.Department of Oral Maxillofacial Surgery，Xi'an Jiaotong University Stomatology Hospital，Xian 710004，Shaanxi，China；4.Department of Stomatology，People's Hospital of Zaozhuang，Zaozhuang 277000，

Shandong，China）

Abstract： Objective Hemangioma endothelial cell （HemEC） which is cultured in vitro is intervened by different concentrations of propranolol. To verify the effect of Bax on propranolo induced HemEC apoptosis. Methods Different concentrations of propranolol were added to HemEC which was cultured in vitro， select the most meaningful group and time point. Adopt the Bax activator to build the high model and the low expression group. The effect of expression difference on apoptosis of endothelial cells in hemangioma was detected. Results After intervented， the HemECs performanced apoptotic morphological changes， as the drug concentration and the intervention time increased， the apoptosis rate increased too. The intervention factors that be intervented by 300μmol/L after 24 hours which apoptosis rate was 28.49% is believed to be significance. With the high expression of Bax mRNA，after propranolol intervention， BAM7+propranolol>DMSO+propranolol>propranolol>BAM7>control group. With the low expression groups，after propranolol intervention， Bax siRNA+propranolol>N.C siRNA+ propranolol>transfection reagent+propranolol>propranolol>control group. Conclusion The optimal concentration and time point of pronaphthol in inducing apoptosis of endothelial cells in hemangioma was 300 mol/L of pronaphthol intervention for 24 hours.Bax gene is closely related with HemEC apoptosis induced by propranolol， the higher expression of Bax gene， the ability to induce the apoptosis is stronger.

Key words： propranolol； hemangioma； apoptosis； Bax； BAM7； siRNA

血管瘤是婴幼儿最常见的血管源性良性肿瘤[1]，新生儿的患病率约为2%～3%，1岁以内血管瘤患病率达10%[2]。血管瘤可存在于身体的任何部位，但是主要发生在头颈部区域（60%）[3]，其次是躯干（25%）和四肢（15%）。血管瘤在患儿刚出生时通常很难被察觉，常伴随明显的生物学行为：在患儿出生1周后进入迅速生长阶段；在患儿3～6月期间持续增殖；稳定几个月后，于患儿1岁以后进入自发消退阶段，此消退过程通常持续5～7年[4]。目前关于血管瘤的消退机制更倾向于是由细胞凋亡引起的。研究发现消退期的婴幼儿血管瘤的凋亡率是增殖期的5倍，而且凋亡的主要是血管瘤内皮细胞（Hemangioma endothelia cell， HemEC）[5]。消退期婴幼儿血管瘤组织中，Fas、Bax、Caspase-3等凋亡相关基因呈高表达，而凋亡抑制基因Bcl-2表达则相对较低[6]。本课题研究Bax的表达量与普萘洛尔诱导体外培养的人血管瘤内皮细胞凋亡的关系，为明确血管瘤内皮细胞的凋亡途径奠定分子生物学基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和检测仪器：盐酸普萘洛尔粉剂（武汉欣欣佳丽生物科技有限公司）、SABC免疫细胞化学试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）、AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒（上海七海复泰生物科技有限公司）、BAM7（美国Med Chem Express公司）；Real Time PCR仪（美国Bio-Rad公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix（日本TaKaRa公司）；Trizol Reagent（美国ambion公司）；SYBR Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）；DNA Transfection Reogent（美国Polyplus公司）；siRNA合成（上海吉玛制药有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 细胞培养及鉴定：血管瘤内皮细胞来源于西安交通大学第二附属医院小儿外科惠赠的人增殖期血管瘤内皮细胞，将其培养于含10%胎牛血清的1 640培养基中，37℃、5% CO2细胞培养箱中传代培养，一般选择细胞性状相对稳定的第5～6代细胞。在倒置相差显微镜下观察并记录细胞形态，并用免疫细胞化学法检测第Ⅷ凝血因子相关抗原的表达。

1.3 不同浓度普萘洛尔溶液干预：细胞分组：空白对照组： 0μmol/L；实验组：100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L。取处于对数生长期的人血管瘤内皮细胞，接种于12孔板中，每组设3个复孔，分别加入不同浓度的普萘洛尔溶液（100、200、300、400umol/L，24h），倒置显微镜下连续动态观察24h，分别记录（0h、6h、12h、18h、24h）细胞的形态变化。同时用AnnexinV-FITC/PI双染法检测血管瘤内皮细胞的凋亡。筛选出本次实验所用的药物浓度和作用时间。

1.4 Bax高表达细胞模型的构建：取对数期的细胞铺6孔板后培养24h，细胞贴壁后，分别加入Bax激活剂BAM7，其浓度依次为1μmol/L、1.65μmol/L、3.75μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L。分别处理1h、3h、6h、12h，换液，加入普萘洛尔溶液，筛选出有意义的BAM7浓度及预处理时间组。

1.5 Bax低表达细胞模型的构建：利用NCBI数据库获取人Bax mRNA的序列全长（NM_001291428）结合Roche公司提供的RNAi软件设计和文献报道，确定Bax siRNA和阴性对照siRNA（合成的siRNA序列模板见表1），应用blast软件在人类基因组中进行比对以保证和其他基因没有同源性，由上海吉玛基因化学合成。

表1 Bax siRNA模板序列

siRNA Sequence

Bax siRNA-1（sense） 5-GGUGCCGGAACUGAUCAGATT-3

Bax siRNA-1（antisense） 3-TTCCACGGCCUUGACUAGUCU-5

Bax siRNA-2（sense） 5-AACUGAUCAGAACCAUCAUGG-3

Bax siRNA-2（antisense） 3-UUGACUAGUCUUGGUAGUACC-5

Bax siRNA-3（sense） 5-CCAUCAUGGGCUGGACAUUTT-3

Bax siRNA-3（antisense） 3-TTGGUAGUACCCGACCUGUAA-5

N.C siRNA-RL（sense） 5-GCGACGAUCUGCCUAAGAUTT-3

N.C siRNA-RL（antisense） 3-TTCGCUGCUAGACGGAUUCUA-5

取对数生长期的HemEC接种于12孔板中，培养约24h，加入siRNA-jetPRIME复合物，然后置于培养箱中生长，培养24～72h。实验组分为siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3三组，对照组分为空白对照组、转染试剂组、阴性对照组。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.6 qRT-PCR检测Bax高表达及低表达时HemEC模型的构建：6孔板培养HemEC，加入1ml Trizol试剂裂解；加入200μl氯仿，冰上放置5min，4℃，12 000转/min离心15min，吸取上层水相至另一Ep管中，加入500μl异丙醇，4℃，12 000转/min离心10min；棄去上清液，75%乙醇悬浮沉淀，4℃，7 500转/min离心5min；弃去上清，室温晾干，加入DEPC水溶解沉淀。NanoDrop 1 000分光光度计（Nucleic Acids）检测所提取的mRNA的浓度与纯度，即A260/A280值及RNA浓度。按照TaKaRa公司说明书进一步进行逆转录和Real Time PCR反应，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，每个样本设3个平行复孔，并重复进行3次独立实验。2-△△CT表示Real Time PCR实验中分析基因表达的相对变化。

1.7 Bax高表达时HemEC凋亡率的检测：①实验分组：空白对照组、普萘洛尔组、DMSO+普萘洛尔组、BAM7组、BAM7+普萘洛尔组；②依据所购上海七海生物公司AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作；③实验可重复性：每组样本均设置3个复孔，并重复3次独立实验。

1.8 Bax低表达时HemEC凋亡率的检测：①实验分组：实验分为5组：空白对照组、普萘洛尔组、转染试剂+普萘洛尔组、N.C siRNA+普萘洛尔组、Bax低表达组（siRNA+普萘洛尔组）；②加入普萘洛尔：a.siRNA转染后24h，换液后加入普萘洛尔；b.调整药物浓度为300μmol/L，药物作用24h后取样待检；c.依据所购上海七海生物公司AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作；③实验可重复性：每组样本均设置3个复孔，并重复3次独立实验。

1.9 统计学分析：采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计分析，实验所得数据以均数±标准差形式表示，采用独立样本t检验进行显著性检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管瘤内皮细胞鉴定：血管瘤内皮细胞在培养瓶生长良好，采用倒置相差显微镜观察可见：细胞单层贴壁生长，多角形或卵圆形，排列紧张时镶嵌排列，似“铺路石”样结构，有接触抑制现象，高倍镜下可见细胞伪足充分伸展，界限清晰。见图1。

凋亡率的结果提示：BAM7+普萘洛尔组>DMSO+普萘洛尔组>普萘洛尔组>BAM7组>空白对照组，说明DMSO本身能对细胞造成一定的损害，由于BAM7是由DMSO配制的，为排除DMSO对细胞的影响，设置了DMSO+普萘洛尔组，发现其与普萘洛尔组的凋亡率无明显差异；BAM7组与空白对照组无差异说明Bax水平本身上调并不会引起细胞凋亡，只有当BAM7与普萘洛尔同时作用时才能诱导HemEC凋亡率上升，与普萘洛尔组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.6 Bax低表达细胞模型的建立：将N.C siRNA、Bax siRNA01、Bax siRNA02、Bax siRNA03（antisense）转染HemEC，Real-time PCR筛选出能最大程度沉默Bax基因的siRNA，结果如图6所示，故本实验选择Bax siRNA01转染细胞来构建Bax的低表达模型。

2.7 Bax低表达时HemEC凋亡率检测：用流式细胞仪检测Bax低表达情况下普萘洛尔对HemEC凋亡的影响。凋亡率结果，Bax siRNA+普萘洛尔组>N.C siRNA+普萘洛尔组>转染试剂+普萘洛尔组>普萘洛尔组>空白对照组，说明转染试剂本身有一定的细胞毒性，在siRNA诱导Bax基因低表达时，细胞凋亡率无明显差异。见图7。

3 讨论

婴幼儿血管瘤增殖期，HemEC处于分裂活跃阶段，婴幼儿血管瘤消退期，HemEC则表现为凋亡状态，HemEC增殖与凋亡的病理失衡状态，才是婴幼儿血管瘤生物学行为的本质所在，因而许多学者认为婴幼儿血管瘤的自然消退与HemEC的凋亡密切相关[2，4，7]，并且有研究证实普萘洛尔可以诱导体外培养的HemEC的凋亡或抑制其增殖[8-10]。

本实验中的HemEC来源于增殖期婴幼儿血管瘤组织，体外培养可见细胞处于分裂增生活跃状态，细胞自发凋亡少。加入不同浓度的普萘洛尔药物后，倒置显微镜观察细胞形态学变化，发现当普萘洛尔浓度低于400?mol/L时，细胞收缩、变圆，细胞界限模糊、间隙增大，细胞脱壁、游离，但细胞膜仍保持完整，这些现象均符合细胞凋亡的特性。由此笔者可以得出普萘洛尔诱导婴幼儿血管瘤消退可能与HemEC的凋亡有关。

Bax是Bcl-2基因家族中的重要调节者，Bid、Bim可作为活化剂，直接激活Bax，触发Cytc的释放；Bad、Nova等与抗凋亡蛋白竞争性结合替换出Bid、Bim等间接激活Bax[11]。它能与凋亡抑制基因Bcl-2等结合形成异二聚体，从而中和它们的作用，Bax自身可形成同二聚体Bax/Bax，正常细胞中，Bax是以非激活单体形式存在，凋亡信号被激活后，Bax构象发生改变，激活Bax蛋白[12]，发出线粒体定位信号从而聚集到线粒体上，进而介导线粒体凋亡，因而Bax易位到线粒体上是线粒体凋亡信号转导中的关键。

研究[13]表明用免疫组化法染色的婴幼儿血管瘤组织中Bax和Bcl-2均有表达，在婴幼儿血管瘤增殖期Bcl-2表达升高，Bcl-2/Bax结合增多， 抑制细胞凋亡， 消退期中Bax表达上调， Bax/Bax结合增多， 促进细胞凋亡， 这些研究结果提示Bax与Bcl-2比率的变化可能导致婴幼儿血管瘤从增殖期进入消退期[14]。研究[15]表明口服普萘洛尔治疗后的婴幼儿血管瘤组织较普萘洛尔治疗前的婴幼儿血管瘤组织中的Bax、Caspase-9基因的mRNA和蛋白表达水平上升，Bcl-2表达水平下降。

前期实验中研究团队检测到了Bax的mRNA和蛋白表达水平在普萘洛尔诱导后的HemEC中表达上调，体外研究也证实了消退期的血管瘤组织中有Bax的高表达。BAM7是由Gavathiotis[16]提出的一种小分子化合物，有BH3结构域凹槽能直接特异性的激活Bax，参与Bax的触发位点，促进Bax的寡聚化，有效激活Bax线粒体转位的发生，能以Bax依赖的方式诱导细胞凋亡。据文献报道在成神经细胞瘤细胞、Hela细胞等肿瘤细胞中特异性激活Bax进而诱导细胞凋亡[17-19]。本实验在以往报道的基础上，设置浓度梯度和时间梯度实验，筛选出最佳作用浓度和时间，即5μmol/L的BAM7预处理1h可以明显上调Bax。研究还通过siRNA技术[20]沉默Bax基因后转入细胞内，qRT-PCR显示Bax明显受到抑制。

通过实验研究，Bax基因高表达时，普萘洛尔誘导的HemEC凋亡率明显上升，这说明Bax参与了普萘洛尔诱导的HemEC凋亡。但当Bax基因沉默后，细胞凋亡率并未明显下降。这一方面提示Bcl-2家族蛋白种类繁多，且蛋白之间存在协同作用，当Bax表达下降时，Bcl-Xs等可以继续与Bcl-2形成异源二聚体，或者Bak可以将Bcl-2/Bax二聚体中的Bax置换出来，使Bax游离出来形成同源二聚体等，因而细胞凋亡并未受到明显抑制；另一方面也提示普萘洛尔诱导HemEC的凋亡并非只有p53/Bax这一线粒体信号传导途径，还可能通过膜受体等其它途径介导HemEC发生凋亡。

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[收稿日期]2018-10-12 [修回日期]2018-11-19

编辑/贾敏

本文引用格式：姚天华，Krishna Regmi，杜婧婷，等.Bax在普萘洛尔诱导人血管瘤内皮细胞凋亡中的作用[J].中国美容医学，2019，28（1）：100-104.