MPTP诱导树鼩帕金森疾病模型行为学检测方法研究

张志成 ， 宋庆凯 ， 黎晓慧 ， 李 娜 ， 黄 鑫 ， 袁 圆 ， 王 璇 ， 李明学 ， 代解杰

（1. 昆明医科大学， 昆明 650500; 2. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心， 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队， 昆明 650118)

帕金森疾病(Parkinson’s disease， PD)是一种由遗传和环境因素相互作用引起的复杂神经退行性疾病， 发病机制尚不清楚。PD在疾病的早期阶段有较好的对症治疗方法， 但这些治疗方法并不会改变疾病的进程。随着PD的进展， 步态变化和姿势不稳定性显著[1]。PD患者的姿势不稳定常导致跌倒， 转身或加重时导致各种损伤[2]。步态障碍与静止性震颤严重影响着PD患者的生活质量， 改善PD患者的运动症状是当前研究的一个热点问题。传统的PD行为学检测方法， 如转棒实验[3]、爬竿实验[4]等， 不适用于善于跳跃、胆小易惊的树鼩。本研究拟采用Catwalk步态分析系统、Force Plate Actimeter(FPA)分析系统对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP)致树鼩急性PD模型的步态变化及肌肉震颤变化进行分析， 旨在探索树鼩PD模型新的行为学研究方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取成年普通级雄性滇缅树鼩14只， 2岁， 体质量为(147.6±17.07) g， 由中国医学科学院医学生物研究所树鼩种质资源中心 [SCXK(滇)K2013-0001]提供。饲养于树鼩种质资源中心普通环境中[SYXK(滇)K2013-0001]，自由饮食，适应性饲养一周后进行仪器的适应性训练，训练方法参考文献[5]进行。随机分为模型组(n=10)和对照组(n=4)，造模后对其进行行为学检测，所有实验操作均获得伦理委员会批准[DWSP201801-004]。

1.2 试剂与仪器

MPTP (Sigma公司，美国)，CatWalk步态分析系统(CatWalkTMXT，Noldus公司，荷兰)，FPA分析系统(Basi公司， 美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 树鼩PD模型的建立 实验树鼩每日腹腔注射MPTP-HCl (4 mg/kg) 连续5 d，对照组注射同体积0.9%氯化钠溶液[6]。

1.3.2 行为学检测方法 造模后1 d对树鼩进行行为学数据采集。CatWalk步态分析系统(图1)： 数据采集时，每只待测树鼩必须无停顿通过检测通道，每次至少3步，重复3次以上; FPA分析系统： 每次检测前校正平板的四个压力检测装置，然后将树鼩至于封闭的检测系统中，每只每次40 min。

本研究中，选取以下参数进行分析： 站立时相持续时间(stand， s)： 爪印与玻璃板接触的持续时间;最大接触面积(max contact area， cm2)： 爪印与平板的最大接触面积; 平均压力(mean intensity， g)： 整个行走过程中，爪印与平板接触过程中产生的平均压力; 举步时相持续时间(swing， s)： 爪印不与平板接触的时间；跨步周期(step cycle， s)： 同一爪子接触平板后到下一次接触平板的时间; 身体速度变化率(body speed variation， %)： 通过将身体速度和平均速度之间的绝对差值除以平均速度来计算; 支持基础(base of support， cm)： 前爪间或后爪间的平均距离;爪印位置(print positions， cm)： 同一跨步周期前爪和后爪间的距离; 平均力量(force average， g)： 整个检测时段，检测平板接受的平均压力; BLM指数(bout of low mobility)： 检测时限里计数低运动性出现的次数，每出现1次记为1; 测量区域(area measure)： 显示检测周期中动物覆盖的总面积，通过将每三个连续点创建的三角形面积求和而计算出来; 空间利用指数(spatial statistic)： 测量整个平板上动物活动的分布，空间统计值为100表示动物花在一个方格中的所有时间，空间统计值1表示平板上的所有方块均等使用，本实验将数值＞30定为空间利用能力未受损;刻板评分(focused stereotopy)： 该分数是基于检测期间内动物运动的量和力的变化来计算的; 震颤指数(tremor indices， TI)： 特定频率的肌肉震颤程度，其量化了高频率段与低频率段之间的力量差异。

1.4 统计学方法

使用SPSS24.0及GraphPad Prism7进行统计学分析， 计量资料以 x- ± s表示， 计数资料以率(%)表示，计量资料组间比较采用成组t检验、计数资料采用x2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1 Catwalk步态分析系统指标示意图Figure 1 Catwalk gait analysis system indicators schematic

2 结果

2.1 MPTP诱导的树鼩行为学表现

树鼩在MPTP注射第5日时均出现典型的肉眼可见的PD运动症状，包括姿势异常、肌肉震颤、站立不稳，代表造模成功。肉眼可见的运动症状短时间内可恢复正常。对照组无异常表现(图2)。

2.2 行为学检测

2.2.1 空间和速度指标 平均速度、测量区域、站立时相持续时间、运动距离指标，虽然有所变化，但差异不具统计学意义。空间利用指数下降、BLM指数显著升高(P均＜0.001)(表1)。

2.2.2 步态与肌肉震颤相关指标 造模后，步态指标中支持基础、跨步周期、身体速度变化率、爪印位置、站立相等， 差异无统计学意义(P均＞0.05)，三足支撑、四足支撑比例有所升高，表明树鼩运动能力未受到明显损伤。爪印相关指标中，树鼩RF、LF最大接触面积减少(P均＜0.05)，后爪无明显差异; RF、RH、LF爪印最大接触面积平均压力，RF、RH、LF爪印平均压力，四肢平均力量均下降(P均＜0.01); 举步速度(LF)变快(P＜0.05); 反应肌肉震颤程度的TI1(0～15 Hz)升高显著(P＜0.01)。结果见表2。

图2 造模后树鼩典型的PD运动症状Figure 2 Typical PD movement symptoms of tree shrews after modeling

表1 树鼩空间和速度相关指标Table 1 The space and speed related indexes of tree shrew

3 讨论

MPTP是一种广泛用于制作PD动物模型的神经毒素，主要通过氧化损伤和抑制线粒体呼吸链复合物杀死多巴胺能神经元[7]。MPTP小鼠模型是测试神经保护剂有效性的经典模型， 但是在神经毒素模型中显示，具有神经保护作用的许多化合物在临床试验中失败[8]，可能由于啮齿动物多巴胺(DA)神经元中无神经黑色素表达且存在DA补偿机制[9]。树鼩在生理解剖、神经发育及心理应激模式等方面与灵长类，甚至人类高度相似，广泛应用于生物医药研究领域[10，11]。本中心前期研究[6]显示，MPTP可致树鼩PD样症状，纹状体DA和多巴胺脱羧酶抗体(DOPA)水平显著降低， 脑中α-synuclein mRNA水平升高，提示树鼩是良好的PD动物模型，本实验在此基础上，探索树鼩PD的行为学变化。

本文研究显示，树鼩MPTP建模后，平均速度、测量区域、站立时相持续时间、运动距离、支持基础、跨步周期、身体速度变化率、爪印位置、站立相等指标，虽然有所变化，但差异不具统计学意义，但可以看出三足支撑、四足支撑比例有所升高。空间利用指数下降、BLM指数显著升高(P均＜0.001)，表明树鼩空间利用能力受损、活动度下降，符合PD运动能力下降的特征。但四肢举步速度中LF加快，这与Kim等[12]研究PD模型大鼠的肌肉僵直和运动功能减退可引起步幅和四肢摆动速度显著减少的结论不一致。

PD步态相关研究[13，14]表明，步幅、支撑点、最大接触面积等可作为大鼠、小鼠PD步态分析的定量指标。本研究结果显示，MPTP致树鼩PD的步态分析中，步幅、支撑点并不存在统计学差异，不能作为树鼩定量分析的指标。而RF、LF最大接触面积减少，可作为PD步态分析的定量指标。其他爪印相关指标中，如RF、RH、LF爪印最大接触面积平均压力，RF、RH、LF爪印平均压力，四肢平均力量均下降(P均＜0.05)，反映了树鼩肌肉僵硬度升高，可以作为PD步态分析的定量指标。

表2 树鼩步态与肌肉震颤相关指标Table 2 The Gait and muscle tremor related index of tree shrew

PD患者有着0～6 Hz的静止性震颤[15]。杨谦谦等[16]采用MP150多通道生理信号采集器研究PD肌肉震颤情况，结果显示部分大鼠肌肉震颤频率和幅度均增加。本研究FPA检测结果显示，建模后与对照组相比，树鼩在0～15 Hz(TI1)震颤显著，差异具有统计学意义(P＜0.01)。TI2(15～25 Hz)虽然也上升明显，但未达到统计学意义的差异。FDA检测系统对动物无干扰、不束缚，不会产生应激性生理变化，相比生理信号采集器，结果更可信、方法更简单。

PD患者的节奏性步行受短步幅和低速的阻碍，这与DA水平的降低有关[17]。步态障碍的研究可采用慢性的PD造模方案。PD早期通常不出现姿势平衡障碍[18]，根据《2016中国帕金森病诊断标准》[19]，新的诊断标准为了提高早期诊断率，去掉了帕金森综合征中“姿势平衡障碍”这一项。“运动迟缓”、“静止性震颤”和“肌强直”3项核心运动症状的检查必须按照统一PD评估量表[20]中所描述的方法进行。

MPTP致树鼩PD模型出现短暂的姿势平衡障碍， 1 d后静止性震颤、肌强直的表现是突出的，能较好模拟PD早期的临床表现。本文行为学研究手段较传统的转棒实验、旷场试验等人为因素更少、检测效率更高、检测指标更广， 提供了一个系统、客观、可靠的行为学研究方法，可综合分析模型的多种行为学特征，值得进一步深入研究和推广。