术后24 h给予莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠保护作用的研究

刘 敏，许栋明，孙芳玲，刘婷婷，李艳菲，王 文*

(1.河北北方学院，河北 张家口 075000；2.首都医科大学宣武医院，北京 100053；3.科学技术部火炬高技术产业开发中心，北京 100045)

缺血性脑卒中在临床上具有“三高”—高发病率、高致残率、高死亡率的特点，一直是临床研究的重点。有研究表明，脑梗死灶周围新生血管密度与患者存活率密切相关，且脑血管的生成可以为神经元重塑提供关键的神经血管基质，从而提升动物和患者的神经功能[1-3]。在动物大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型中，研究学者证实脑缺血24 h后梗死周边内皮细胞开始增殖[4]，第3天新生血管密度增殖达到最大，之后减少，但这个过程短暂而微弱，不足以使梗死周边血流恢复。在血管新生的过程中，一系列促血管生长因子参与调节，这些因子在脑损伤后一定时间内可诱导内皮细胞的增殖和迁移，通过外源性药物，促进内源性血管生长因子的表达，增加血管新生，改善神经功能是目前缺血性脑卒中的有效治疗方法。

莫诺苷(morroniside)是从中药山茱萸中筛选出的一种有效成分。本课题组前期研究表明，其具有抗氧化[5- 6]、抗凋亡[7]、促进内源性神经干细胞增殖[8]的作用。此外，前期研究结果表明[9-13]，在大鼠局灶性脑缺血再灌注3 h后给予莫诺苷，促进血管内皮细胞增殖、促进血管新生、增加血管密度，脑血流量，起到神经保护作用。但临床上发生脑卒中的患者，3 h内大多不能得到及时治疗。因此，进一步研究药物的扩大治疗时间窗具有重要的意义。本研究初步探索在大鼠局灶性脑缺血再灌注后24 h给予莫诺苷的治疗效果，进一步研究其扩大有效治疗时间窗，为临床研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体重260～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号[SCXK(京)2016-0006]，使用许可证号：[SYXK(京)2015-0016]。12 h昼夜循环，饲养温度23℃±2℃，湿度60%±5%。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，术后参照Zea Longa[14]评分法，剔除得分为1分和5分的SD大鼠。剩余大鼠随机分为假手术组， 模型组， 莫诺苷小(30 mg/kg)、 中(90 mg/kg、)、大(270 mg/kg)剂量组，每组各10只，术后24 h开始给予莫诺苷，每天灌胃1次，连续7 d。假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。动物实验过程遵循3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

莫诺苷由本科室从山茱萸中提取制备，淡黄色粉末，高效液相色谱法分析其纯度大于95%。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)：北京化学试剂公司。BCA试剂盒：北京普利莱基因技术有限公司。RIPA 裂解液(强)：碧云天生物技术研究所。兔抗Ang-1一抗：武汉博士德生物技术有限公司。兔抗CD34一抗：美国Santa Cruz公司。小鼠抗β-actin一抗：北京中杉金桥生物有限公司。山羊抗兔IgG(H+L)-HRP：北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备

SD大鼠术前12 h禁食不禁水，腹腔注射麻醉，将其仰卧固定，颈部常规消毒，颈正中切开大约2 cm，逐层钝性分离出右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA)。结扎ECA分叉处和CCA的近心端，动脉夹夹闭ICA。用眼科剪在CCA上剪一切口，插入栓线18 mm，到达大脑前动脉起始处发现有阻挡感。一并结扎栓线和ICA，松开动脉夹，30 min后缓慢拔出线栓，缝合肌肉，碘酒消毒。假手术组操作方法相同，但不插线栓。

1.3.2 神经功能行为学评分

采用Zea Longa 5分法进行评分，1分：提鼠尾离地面约33 cm，不能充分伸展对侧前肢；2分：对侧前肢屈曲；3分：置于地面，向对侧行走；4分：向对侧转圈，呈追尾状；5分：对侧瘫痪，无法行走。

1.3.3 大鼠脑梗死体积的测定

SD大鼠连续给药7 d后，腹腔注射麻醉大鼠，立刻断头取脑，放入大鼠脑槽模具中，并沿冠状面切片，水平切5刀，每片厚度2 mm，共6片。切片放入5 mL的TTC染色液中，严格避光，15 min后，用眼科镊将每片翻面，再染15 min后取出，可观察到正常脑组织呈红色，而梗死组织区域呈白色[15]，放入4%多聚甲醛中固定24 h，取出脑片用滤纸吸干，放扫描仪中进行扫描，将照片导入计算机，用图像分析软件Image Pro-plus计算。按照如下公式计算：脑梗死体积百分比(%)=(脑片总梗死面积/脑片总面积)×100%。

1.3.4 Western blotting

术后第8天，SD大鼠麻醉处死，右侧皮层脑组织新鲜取出，将其裂解，离心，取上清液BCA法进行蛋白定量，通过10%～15%SDS-PAGE电泳，上样后，先恒压60 V电泳，待样品从浓缩胶进入分离胶时，调至120 V后至溴酚蓝到达凝胶底部，转移到硝酸纤维素(NC)膜。室温下在5%脱脂奶粉中封闭1 h，加入按说明书稀释比例后的Ang-1，CD34一抗，放4℃静置过夜。用1×TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育1 h，洗膜后加入ECL显色剂曝光。将数据导入软件Quantity one中进行分析，分别计算出目标蛋白条带灰度值(A值)，以A值/对应β-actin的比值作为蛋白水平的定量指标，进行比较统计。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 神经功能行为学评分

术后0 d Zea Longa评分，模型组和剂量组大鼠均发生神经功能损伤，且Zea Longa评分没有统计学差异，提示造模成功，模型稳定。与假手术相比，有显著性差异 (P<0.001)；术后24 h给予莫诺苷7 d的后，莫诺苷大剂量组(270 mg/kg)与模型组比较，神经功能行为学评分明显降低(P<0.01)，说明大剂量莫诺苷在大鼠脑损伤可起到神经保护作用。(图1)

注：与假手术相比，###P<0.001; 与模型组相比，**P<0.01。图1 MCAO后24 h给予莫诺苷对神经功能评分的影响Note. Compared with the sham group,###P<0.001;Compared with the MCAO group, **P<0.01.Figure 1 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the neurological score

2.2 脑梗死体积百分比

与假手术组相比，模型组大鼠脑梗死体积百分比显著增加(P<0.001)。莫诺苷剂量组大鼠比模型组的脑梗死体积百分比减少，其中小和中剂量组与模型组相比没有统计学差异，而大剂量组有显著性差异(P<0.05)，说明大剂量莫诺苷可减少脑梗死体积。(图2)

注：(A)各组大鼠TTC图片；(B)各组大鼠梗死体积百分比的统计结果。与假手术组相比，###P<0.001; 与模型组相比， *P<0.05。图2 MCAO后24 h给予莫诺苷对TTC染色的影响Note. (A) The picture of rats in all groups; (B) The statistical results of cerebral infarction volume ratios of rats in all groups.Compared with the sham group,###P<0.001; Compared with the MCAO group, *P<0.05.Figure 2 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the cerebral infaction volumes

2.3 皮层血管新生相关蛋白CD34和Ang-1的表达

术后第8天，与假手术相比，模型组大鼠缺血侧皮层CD34和Ang-1的蛋白表达均增加(P<0.05，P<0.05)。与模型组相比，莫诺苷小和中剂量组大鼠缺血侧皮层CD34和Ang-1的表达水平有所增加，其中中剂量组大鼠缺血侧皮层Ang-1表达有显著性差异(P<0.05)。莫诺苷大剂量组与模型组相比缺血侧皮层CD34和Ang-1的表达显著增加，有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，说明大剂量莫诺苷在脑损伤后能更多的促使CD34和Ang-1的表达。(图3、图4)

注：(A)各组大鼠缺血侧皮层CD34表达水平；a:假手术组;b:模型组;c:莫诺苷小剂量组;d:莫诺苷中剂量组;e:莫诺苷大剂量组。(B)各组大鼠缺血侧皮层CD34相对表达定量结果。与假手术组相比，#P<0.05; 与模型组相比，**P<0.01，。图3 MCAO后24 h给予莫诺苷对CD34表达的影响Note. (A) The expression level of CD34 in ischemic hemisphere of rats in all groups; a:Sham; b:MCAO; c:Morroniside low-dose group; d:Morroniside moderate-dose group; e: Morroniside high-dose group.(B) The relative expression level of CD34 in ischemic hemisphere of rats in all groups,。Compared with the sham group,#P<0.05; Compared with the MCAO group,**P<0.01.Figure 3 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the CD34 expression

注：(A)各组大鼠缺血侧皮层Ang-1表达水平；a:假手术组;b:模型组;c:莫诺苷小剂量组;d:莫诺苷中剂量组;e:莫诺苷大剂量组。(B)各组大鼠缺血侧皮层Ang-1相对表达定量结果。与假手术组相比，#P<0.05; 与模型组相比，*P<0.05。图4 MCAO后24 h给予莫诺苷对Ang-1表达的影响Note. (A) The expression level of CD34 in ischemic hemisphere of rats in all groups; a:Sham; b:MCAO; c:Morroniside low-dose group; d:Morroniside middle-dose group; e: Morroniside high-dose group. (B) The relative expression quantitative level of CD34 in ischemic hemisphere of rats inall groups. Compared with the sham group, #P<0.05; Compared with the MCAO group, *P<0.01.Figure 4 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the Ang-1 expression

3 讨论

缺血性脑卒中是引起全球第二大常见死亡原因和致残原因。目前临床上普遍认为使用重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓是最为有效治疗方式[16]，但其具有狭窄治疗时间窗，病人很少能在发病后4～5 h得到有效溶栓，因此亟需探索新的治疗方法。有研究表明，在缺血早期抗炎、抗凋亡，缺血后期通过促进血管新生、神经发生可以使组织修复与再生[17-18]。莫诺苷是从中药山茱萸中筛选出的有效成分，经前期研究表明，大鼠MCAO模型术后3 h给予莫诺苷，可促进血管长期生成，从而改善微血管循环，减少梗死体积并恢复神经功能[10, 12]。本研究基于前期研究，扩大其治疗时间窗，发现大鼠脑损伤后24 h给予大剂量莫诺苷，也可促进血管新生，改善神经功能，起到保护作用。

脑损伤后，其恢复过程复杂且富有动态性，而梗死周边血液供应的恢复对改善神经功能至关重要[19]。血管新生可减轻受损脑组织氧气和营养的供应不足，作为一种长期的天然防御机制。CD34+细胞是骨髓单核细胞(BMMNC)的子集，是造血和内皮细胞前体的主要内源性来源细胞[20]。在外周血中CD34+细胞含量极少，但脑损伤后，在动员剂作用下，从骨髓迁移至外周，最后归巢于脑梗死缺血区，分化为成熟内皮细胞，参与血管新生和修复[21]。因此，CD34作为观察血管新生的重要指标。本研究表明，脑损伤后，与对照组相比，模型组CD34蛋白表达水平增加(P<0.05)，提示CD34+细胞迁移至外周，与Paczkowska 等的研究结果一致[22]。而给予大剂量(270 mg/kg)莫诺苷，与模型组比较，可使CD34蛋白的表达显著增加(P<0.01)。血管生成素-1(Ang-1)是调节血管生成的生长因子，可阻止内皮细胞凋亡，并刺激其增值[23]。因此，Ang-1对于新生血管的形成、重塑、成熟起着十分重要的作用，其蛋白的表达水平与缺血周边区的血管发生密切相关。本研究显示，与模型组相比，给予中(90 mg/kg)，大(270 mg/kg)剂量莫诺苷能显著促进Ang-1蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，提示造模后24 h给予莫诺苷可能对血管新生有一定的促进作用。有研究表明，血管生成的生长因子不仅能促进血管新生，减少大脑梗死体积，而且可促进神经干细胞增殖，迁移和分化[24]，改善神经功能。本门课题组为了进一步验证，造模后24 h给予莫诺苷是否对脑梗死体积和神经功能有影响。本课题组进行了TTC染色和Zea Longa评分。本研究结果也显示，莫诺苷大剂量组与模型组相比，显著降低了神经功能评分(P<0.01)，且明显降低脑梗死体积(P<0.05)。

综上所述，局灶性脑缺血再灌注24 h后给予莫诺苷治疗后，CD34和Ang-1蛋白表达水平进一步增加，促进脑梗死灶周边血管新生，减少脑梗死体积，从而有利于恢复神经功能。