诺如病毒感染树鼩小动物模型的初步探索与思考

郭伦爱, 戴迎春, 陈俊锐, 段文韬, 张绪富*

(1.南方医科大学中医药学院，广州 510515；2.南方医科大学公共卫生学院流行病学系，广州 510515)

人诺如病毒(human noroviruses,HuNoVs)是全球范围内引起成人和儿童非细菌性急性胃肠炎暴发流行的重要病原体，其中60%～90%的HuNoVs急性胃肠炎由GII.4型HuNoVs导致[1]。HuNoVs可在所有年龄段、不同的半密闭场所(幼儿园、学校、餐馆医院等)引起暴发。据美国疾病控制中心统计，美国每年至少有2300万HuNoVs导致的病毒性胃肠炎病例，其中800例死亡，发展中国家每年因HuNoVs感染而死亡的5岁以下儿童高达21.8万[2-3]。由于至今尚未建立有效的HuNoVs体外培养系统和小动物感染模型，抗HuNoVs药物和疫苗研究进展缓慢[4]。

树鼩(Tupaiabelangeri，tree shrew)作为灵长类动物的近亲，在生理解剖、神经发育、病毒感染特性及心理应激模式等方面与灵长类甚至人类之间存在高度的相似性，诸多报道显示树鼩能感染人类甲肝、乙肝、丙肝、轮状、柯萨奇和疱疹等病毒[5-6]，目前已被广泛应用于医学生物学领域。树鼩能否感染HuNoVs尚未见报道，本研究首次探索树鼩作为HuNoVs感染小动物模型的可行性并分析讨论了该领域存在的困难和未来的研究方向。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

实验用滇西亚种普通级雄性树鼩由中国科学院昆明动物研究所提供[SCXK(滇)K2017-0003]，6月龄，体重约120～150 g，动物实验在中国科学院昆明灵长类研究中心进行[SYXK(滇)K2017-0008]，动物单只饲养于不锈钢笼中，室温维持在25℃～27℃，人工光照12 h/d，喂以苹果、面包虫、鸡蛋和混合饲料，笼舍定期清洁消毒，实验过程符合伦理委员会要求[IACUC编号：17006]，并按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.1.2 HuNoVs粪便悬液及正常人群唾液样本

实验所用HuNoVs粪便悬液来自于医院临床患者，由本课题组采集保存，经RT-PCR检测和基因序列分析鉴定为HuNoVs GII.4型2010和Sydney株[7]。正常人群唾液样本采集自南方医院儿科临床患者[8]。

1.2 主要试剂与仪器

QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒(52904)，one-step RT-PCR试剂盒(210210)购自QIAGEN 公司，纯化豚鼠抗NoV多抗血清由美国辛辛那提儿科研究中心Jiang Xi教授提供，Blood Group A Antigen(sc-59459)，Blood Group B Antigen(sc-52371)，Blood Group H Antigen(sc-52329)，Lewis a(sc51512)、Lewis b(sc51513)、Lewis x(sc59471)、Lewis y(cas82993)血型抗原购自德国Santa Cruz公司， HRP-羊抗鼠IgG(A21020)购买于AbbKine公司。免疫组化试剂盒(SA1020), HRP-羊抗鼠IgM(BA1075)购自武汉博士德生物科技公司，碳酸氢钠(CC0121)购自北京鼎国生物公司,GeneRuler 1 kb DNA Ladder(SM0312)购买于赛默飞公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HuNoVs灌胃攻毒及样品采集

15只树鼩被随机分为A、B、C 3组，每组5只。HuNoVs粪便悬液灌胃前采集唾液50 μL于清洁试管内用于人类组织血型抗原(histoblood group antigen，HBGAs)检测。HuNoVs攻毒试验方法参考文献[9-10]：树鼩适应性饲养3 d，第4天先进行中和胃酸处理，即每只灌服500 μL 100 mmol/L NaHCO3溶液，根据文献方法[11]进行灌胃攻毒。A、B两组分别灌服GII-4 2010株和Sydney株粪便悬液(200 μL粪便悬液用800 μL PBS稀释，约2×105viral RNA copies)，C组(对照组)灌服1000 μL PBS。攻毒后每天观察树鼩饮食、活动、毛发、精神状态和粪便性状，每天早晨收集粪便样本约1 mL用于病毒检测，并参照下表进行腹泻评分。

表1 腹泻评分表Table 1 Diarrhea score

1.3.2 粪便样本中HuNoVs RNA检测

参照本室建立的稳定检测方法[12]，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒提取粪便标本RNA，以提取所得的RNA 为模板，使用one-step RT-PCR试剂盒，按照说明书进行RT-PCR 扩增。分别设置阳性和阴性对照，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统进行拍照记录。

1.3.3 小肠组织病理标本制作观察以及免疫组化法检测HuNoVs抗原

攻毒后第7天处死树鼩，剪取回肠1 cm，10%甲醛固定2 h进行石蜡包埋。蜡块修整后经切片机切成5 μm薄片，常规HE染色，光镜下观察小肠组织炎症细胞浸润及绒毛上皮损伤等情况并拍照。石蜡切片常规脱蜡和抗原修复处理后，5% BSA 37℃封闭20 min，1∶250豚鼠抗NoV多抗血清4℃过夜，HRP-羊豚鼠IgG二抗37℃ 20 min，滴加SABC后DAB显色，脱水、透明、中性树脂封片后显微镜下观察。

1.3.4 唾液HBGAs表型鉴定[8]

树鼩唾液100℃煮沸10 min后用PBS1∶10稀释，包被于96孔酶联板，5%脱脂奶-PBS封闭，分别加入单抗A、B、H、Lewis a、 Lewis b、Lewis x、Lewis y(1∶300稀释)4℃过夜，加入二抗HRP-羊抗鼠IgG或IgM(1∶3000)后，TMB底物显色，磷酸溶液终止后酶标仪测定OD值，记录结果。

2 结果

2.1 树鼩攻毒后的症状观察和腹泻情况

HuNoVs灌胃攻毒树鼩后，GII-4 2010株组(A组)和Sydney株组(B组)未观察到精神萎靡、体毛蓬松、饮食减少等感染症状，与对照组相比无差异。三组所有树鼩均无明显腹泻情况发生，粪便呈粘稠均匀或半液状均匀状态。

2.2 树鼩粪便HuNoVs RNA检测结果

收集HuNoVs攻毒后连续7 d的树鼩粪便样本，RT-PCR法检测HuNoVs，结果显示三组105份粪便标本均为阴性，图1为部分代表性样品RDRP区域基因的RT-PCR结果，其中阳性对照组条带大小符合预期(387 bp)，其余无条带。

2.3 小肠组织光镜观察和免疫组化结果

HuNoVs灌胃攻毒7 d后处死树鼩，取小肠组织进行HE染色，结果显示三组小肠组织病理改变均不明显，小肠绒毛光整、平滑，固有层无炎症细胞浸润，肠腔无渗出物，结果见图2。进一步利用免疫组化法检测小肠组织中HuNoVs抗原，阳性表达者将在胞膜和胞浆中呈棕黄色，结果显示三组在任意位置均未检测到病毒抗原的存在，结果见图3。

注：M：DNA marker(1 kb)， 1∶2010株， 2：Sydney株， 3：阴性对照， 4～6：对照组， 7～9：感染A组， 10～12感染B组。图1 树鼩粪便悬液部分样品RDRP区域基因的RT-PCR结果Note. M: DNA marker (1 kb), 1∶2010 strains, 2: Sydney strains, 3: Negative control, 4-6: Control group, 7-9: Infection group A, 10-12: Infection group B.Figure 1 RT-PCR results of the amplification of the RDRP region

2.4 树鼩唾液HBGAs分型结果

近年大量分子流行病学研究以及利用HuNoVs对志愿者进行攻击的实验表明，HBGAs是HuNoVs的天然受体或配体，这可能是HuNoVs在人体肠道中受体吸附的一个重要机制。为了进一步明确树鼩外周组织中是否表达HBGAs，对三组15份树鼩唾液进行了HBGAs测定，结果均为阴性，未检测到ABH和Lewis抗原，正常人群的6份唾液中均有不同型别的HBGAs表达，结果见图4。

图3 树鼩小肠组织免疫组化观察(HE染色，×100)Figure 3 Examination of small intestine tissues from tree shrews challenged with HuNoVs (HE staining)

注：1～2：对照组，3～5：感染A组，6～8：感染B组，9～14：正常人群对照。图4 树鼩唾液中HBGAs的检测结果Note. 1-2：Control group，3-5: Infection group A，6-8：Infection group B，9-14：Normal human population control group.Figure 4 Distribution of HBGAs in saliva from tree shrews

3 讨论

HuNoVs作为急性病毒性胃肠炎的重要病原体，在全球范围内带来了沉重的医疗负担和社会公共卫生问题[13]。有效的动物模型是HuNoVs疫苗和抗病毒药物研发的重要环节和保障，也是研究病毒感染进程和致病机理的主要手段。长期以来，HuNoVs小动物感染模型研究仍是HuNoVs领域的热点和难点。

近年来，研究证实悉生猪是目前最有前景的HuNoVs动物感染模型[9-10]。悉生猪在胃肠解剖学结构、生理学、免疫系统等方面与人具有相似的特征，在粘膜表面也存在HBGAs，将其感染人HuNoVs后能导致腹泻、病毒血症，并出现粪便排毒和血清转换，另外，悉生牛动物模型中也证实类似结果[14]。然而，这些悉生大动物饲养繁殖难度大、操作繁琐、价格昂贵等缺点限制了其广泛推广运用[15]。树鼩是一种形似松鼠的小型哺乳动物，具有个体小、成本低、易操作等优点，蛋白质序列同源比对发现树鼩与人的蛋白质相似度高于啮齿类动物，同时一些重要神经系和免疫系统信号通路系统与灵长类动物高度相似，作为实验动物在生命医学领域已被使用30多年。树鼩有诸多与人类相似的病毒相关免疫因子(如淋巴细胞、细胞因子、PRRs及 MHC等)[16]，许多感染特性与人类相似，多项研究表明树鼩能感染人类甲肝、乙肝、丙肝、轮状、疱疹、腺病毒等[17-20]。尤其是树鼩能感染轮状病毒的报道启示相关人员[21]：树鼩能否感染HuNoVs非常值得探索和实践。

本研究首次以HuNoVs的优势流行株GII-4 2010株和Sydney株灌胃攻毒树鼩，探索了其作为HuNoVs感染模型的可行性。遗憾的是，从树鼩的腹泻症状、粪便排泄物的病毒检测，以及小肠组织的病理学和病毒抗原等方面都没有发现HuNoVs感染的证据。研究表明10～100个诺如病毒颗粒即可导致人感染，HuNoVs的悉生猪动物模型[9-10]以及应用悉生猪动物模型进行的疫苗评价试验[11]研究表明:4～5日龄悉生猪灌胃攻毒量约3×104viral RNA copies，本研究攻毒量为2×105viral RNA copies，相当于悉生猪模型中病毒量的5～6倍，所以本研究的攻毒剂量理论上足够感染树鼩。结合近年来HuNoVs感染机制的最新进展，研究人员分析了树鼩未能感染HuNoVs的可能相关因素，并思考了今后的研究方向：

一、大量分子流行病学和分子生物学实验研究证实肠道黏膜上的HBGAs是HuNoVs的病毒受体[15]。HBGAs在肠道上皮细胞上表现为ABH和 Lewis抗原，对应在红细胞上表现为分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。目前研究发现至少共有8 种HuNoVs和组织-血型抗原作用的方式，并可归为2大类：A/B结合型(分泌型结合型)和Lewis结合型(非分泌型结合型)[22-23]。树鼩唾液中未检测到HBGAs血型物质可能与树鼩对HuNoVs不易感有关。今后建立遗传背景清晰、HBGAs遗传成分稳定的种群或品系可能是HuNoVs感染树鼩小动物模型的重要方向。

二、悉生猪(和牛)的HuNoVs动物感染模型[9-10, 14]的成功提示动物肠道的无菌环境可能也是一个重要因素。最新的研究表明阴沟肠杆菌能够抑制HuNoVs感染悉生猪[24]，而且益生菌对HuNoVs感染具有较好的保护作用[25]。后续选用无菌级的SPF树鼩(悉生树鼩或者实验前后对树鼩进行抗菌处理)探索HuNoVs感染小动物模型的努力仍值得期待。