林麝繁育性状候选基因IGF-1的生物信息学分析及遗传效应研究

郑程莉，竭 航，杨 营，冯达勇，唐 婕，付文龙，程建国，蒋桂梅，周 磊*

(1.四川养麝研究所，四川 都江堰 611845；2.重庆市药物种植研究所，重庆 南川 408435；3.陕西省动物研究所，陕西 西安 710032)

【研究意义】麝香(Moschus)是传统中药的重要成分，主要由我国一级重点保护濒危野生药用动物林麝(Moschusberezovskii)雄性个体分泌，麝香价格高昂，究其原因除了巨大的药用价值和极低的产量外，还与圈养林麝有限的种群数量有关。经过多年的人工驯养，林麝的群体数量仍增长缓慢。在生产上，繁殖力是限制麝香基原动物林麝种群数量增长的重要因素，也严重阻碍了麝香产量的提高。现代的统计学证实了动物的产仔数遗传力很低，难以通过表型选择(外形线性评定)来改良[1]。因此，筛选出一些适当的候选基因，从分子水平上寻找调控产仔数的多态性，为林麝选种选育提供理论基础，从而快速准备有效的提高品系选育效果。【前人研究进展】胰岛素样生长因子-I (Insulin-hkegrowthfactor-1,IGF-1)是一个调控动物机体生长、发育和代谢的一个重要生长因子，同时介导生长激素(GH)发挥生物活性，IGF-1基因对动物的繁殖机能有一定的调控作用，主要是借助GH/IGF-1生长轴对生殖系统发挥效应[2]。秦玉梅等(2017)研究发现IGF-1基因与鸡的产蛋性能存在一定的相关性，可作为鸡产蛋性状的分子标记[3]。Echternkamp(2004)研究发现 IGF-1蛋白可增强卵巢的敏感性，降低优势卵泡的抑制性，提高双胎率[4]。Kim.ES等(2009)等对荷斯坦奶牛研究认为IGF-1是双胎的一个潜在的候选基因，IGF-1第二内含子的SNP与双胎率显著相关[5]。M.P Mullen等(2011)研究表明IGF-1中2个SNPs位(IGFliland，IGFli2)和产犊时体况评分显著相关[6]。Wang(2011)研究中国西南十几个品种山羊发现，古兰马羊IGF-1基因微 5′侧翼区多态性与产羔数显著相关(P<0.05)，AC 基因型个体产羔数比 AB 和 AA 高[7]。近年来研究表明，反刍动物IGF-1基因突变与产仔率显著相关[8]。【本研究切入点】本研究旨在克隆IGF-1基因全序列，通过PCR-SSCP技术检测IGF-1基因在林麝中的多态性，分析其与产仔数的关联效应，探讨其作为分子标记可能性，【拟解决的关键问题】为林麝的品系选育提供理论依据，以建立林麝标记辅助选择技术体系。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验采用林麝共36头，其中1头自然死亡林麝用于肝脏组织取样，选自四川养麝研究所都江堰养麝场；35头林麝用于毛发采集(含毛囊)，选自四川养麝研究所马尔康养獐场。采集林麝后腿外侧毛发置于封口袋中，带回实验室置于-20 ℃冰箱中保存备用。查找、收集和整理马尔康养獐场35头林麝从初产到现在的每胎产仔数据。

1.2 主要试剂及仪器

PCR仪(型号为TC1000-G)，台式高速微量(冷冻型)离心机(型号为D3024R)，购自大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；暗箱式三用紫外分析仪(型号为WFH-203B)，购自上海米青科实业有限公司；电泳仪(型号为JY300E)，垂直电泳槽(型号为JY-SC26+)，水平电泳槽(型号为JY-SPAT)，凝胶成像分析系统(型号为JY04S-3E)，购自北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 主要试剂

一管式毛发DNA抽提试剂盒，Master Mix酶， Marker DL2000，核酸燃料，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他药品(琼脂糖、Tris、EDTA、硼酸等)为国内分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 基因组DNA的提取 取20～30根带毛囊的毛发，取其根部，放入1.5 mL离心管中，加入30 μl Qlysis-H Reagent和1 μl Proteinase K，震荡，56 ℃水浴30 min，100 ℃水浴8 min； 12 000 r/min离心3 min，上清液用于PCR反应；用1 %的琼脂糖凝胶检测DNA；根据所测定的值和所需要的DNA的浓度来确DNA的稀释倍数；然后储存在-20 ℃的冰箱中备用。

1.4.2 引物的设计与合成 研究参照GenBank上提交的牛IGF-1基因序列(登录号：X15726.1)，通过引物设计软件Primer Premier 5.0 和Oligo7设计林麝IGF-1基因的克隆引物和SSCP引物，送成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1。

1.4.3 PCR扩增与测序IGF-1基因PCR反应体系(20 μl)： 2×Master PCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O：6 μl。IGF-1基因PCR反应条件如下表2。

1.4.4 生物信息学分析 将克隆测序结果用DNAStar、ExPASy-ProtParam tool、ExPASy-ProScale、NetPhos 2.0、SignalP4.0 Server、PSORT、PBIL-IBCP Lyon-Gerland、motif Scan等软件对所得序列分析。

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增

用肝脏组织提取出的cDNA为模板，经PCR后取4 μl产物经电泳检测，Marker 为DL2000，用引物P1经PCR扩增获得大小为465 bp的IGF-1基因，如图1中IGF1-(2)所示条带。

2.2 生物信息分析

2.2.1 基本理化性质分析 根据测序得知，林麝IGF-1基因cDNA序列全长为465 bp，其中包含1个462 bp的完整的开放阅读框(ORF)；这个开放阅读框包含153个氨基酸残基，包含了1个起始密码子GGA和1个终止密码子TAG，预测的分子量大小为17.05 kDa，分子式为C743H1184N214O216S15，等电点为9.40。根据在线软件ExPASy-ProtParam预测结果显示，带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为11个，带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为22个，这表示这个蛋白可能带正电荷。这个序列不包含任何Trp残基，N端的残基为Met。这个蛋白在体外的活性时间大概为30 h。经过软件计算，这个蛋白的不稳定系数为55.76，这表明这个蛋白在理化性质上是不稳定的。脂肪指数为64.68，亲水性为-0.251，这提示此蛋白亲水性差，脂溶性强。

表1 IGH-1基因的PCR扩增的引物序列Table 1 Sequences of primers used in PCR amplification of IGH-1

表2 IGF-1基因引物PCR扩增程序Table 2 PCR programs for two primer pairs of IGF-1 gene

2.2.2 IGF-1蛋白磷酸化位点预测 由图2所示，用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测林麝IGF-1氨基酸序列，发现有15个磷酸化位点，分别是9个Ser磷酸化位点、4个Thr磷酸化位点和2个Tyr磷酸化位点。

图1 IGF-1基因PCR扩增图Fig.1 PCR amplified figure of IGF-1 gene

2.2.3 IGF-1蛋白信号肽分析 如图3所示，利用ExPASy的SignalP-4.0程序预测林麝IGF-1蛋白是否含有信号肽。林麝IGF-1蛋白是一个分泌性蛋白，预测的肽段切割位点在第49和50位氨基酸之间。利用在线TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/)分析发现 IGF-1不是跨膜蛋白。通过PSORT(http://psort.hgc.jp/)对IGF-1蛋白进行定位，发现65.2 %存在于细胞核中，17.4 %存在于线粒体中，4.3 %存在于囊泡分泌系统中，4.3 %存在于细胞质中，4.3 %存在于细胞外(包括细胞壁)， 4.3 %存在于内质网中。

2.2.4 IGF-1蛋白质二级结构的预测 由图4所示，通过PBIL-IBCP Lyon-Gerland中的蛋白质二级结构预测软件NPS@中的GOR对IGF-1氨基酸序列进行二级结构预测。预测结果显示：预测氨基酸序列中包含α-螺旋：23.38 %；无规卷曲：70.13 %；延伸片断：6.49 %。

图2 IGF-1蛋白磷酸化位点预测Fig.2 Pediction of phosphorylation sites of IGF-1 protein

S为信号肽预测参考值；C是断裂点预测；Y为两者的校正断裂点综合值图3 IGF-1蛋白的信号肽预测Fig.3 Signal peptide prediction of IGF-1 protein

图4 IGF-1蛋白二级结构预测Fig.4 Prediction of secondary structure of IGF-1 protein

2.2.5 IGF-1保守结构域预测 由图5可以看出，通过motif Scan工具(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)，对IGF-1氨基酸序列保守结构域进行预测，结果发现就只有一个保守结构域，IGF-1氨基酸序列52～110位为Insulin(Insulin/IGF/Relaxin)家族典型的保守结构功能域。

2.3 PCR-SSCP结果检测分析

2.3.1IGF-1基因的PCR-SSCP结果检测 由图6所示，对于IGF-1基因SSCP引物的PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的片段与预期大小相一致，没有非特异性扩增条带，但是引物2条带不清晰，其余6条引物可直接进行SSCP分析。

图5 IGF-1蛋白保守结构域预测Fig.5 Prediction of conserved structure domain of IGF-1 protein

1～7PCR扩增产物；M：DL2000标准分子量图6 林麝IGF-1 基因PCR产物(1 %)Fig.6 PCR product of IGF-1 in Moschus berezovskii(1 %)

图7 林麝IGF-1 扩增片段的SSCP分析Fig.7 SSCP analysis of PCR amplification of IGF-1 in Moschus berezovskii

由图7所示，对引物扩增的PCR产物进行SSCP分析，引物扩增片段用10 %的聚丙烯酰胺凝胶进行检测，发现扩增片段没有特异性条带。

2.3.2IGF-1基因引物的测序结果 为证明SSCP扩增结果，选择引物6进行扩增，得到35个毛发样品的PCR产物，并对其产物进行测序，发现6个PCR产物的序列完全一致，没有多态性(图8)。

3 小 结

IGF-1作为IGFs家族的重要成员，在促进蛋白质合成、细胞生长和分化、胚胎发育及代谢调控等方面都发挥着重要的生理作用[9]。目前，国内外对IGF-1受体的相关研究已大量开展，但对于林麝这种高原动物IGF-1基因相关基础研究尚属空白。林麝种群数量的缓慢增长严重制约了其产物麝香产量的提高。IGF-1基因突变与产仔率显著相关，研究林麝IGF-1分子结构和功能特点，分析其序列中多态位点，对建立林麝标记辅助选择技术体系具有重要意义。

图8 林麝IGF-1基因序列比较Fig.8 Sequence comparison of IGF-1 gene in Moschus berezovskii

4 讨 论

4.1 结构与功能

本研究利用生物学相关软件对得到的序列进行分析和预测，其中IGF-1蛋白磷酸化位点预测结果显示，在153个氨基酸残基中，IGF-1蛋白拥有15个磷酸化位点，但以丝氨酸为主，说明高含量的磷酸化位点能够增加该蛋白的活力。

进一步研究发现林麝IGF-1蛋白是一个分泌性蛋白，并且拥有Insulin家族典型的保守结构功能域，预测的肽段切割位点在第49和50位氨基酸之间，主要存在于细胞核中，提示IGF-1作为胞内核受体，通过增加蛋白活力，以引起其结构和功能发生改变，进而作用于一系列信号通路，导致细胞核发生生理生化反应。有研究提示IGF-1蛋白的遗传变异与生物性状的变化有密切关系[10]。

4.2 多态性分析

本试验设计的IGF-1基因的PCR-SSCP扩增片段长度均为300 bp左右，引物扩增片段用10 %的聚丙烯酰胺凝胶进行检测，发现扩增片段没有特异性条带。为证明PCR-SSCP扩增结果，选择其中一条引物对所得的毛发样品进行扩增，测序发现所有PCR产物的序列完全一致，没有多态性。研究表明不能选择IGF-1基因作为林麝的分子遗传标记。

本研究的材料取自四川养麝研究所马尔康养獐场。为响应国务院“变野生动植物为家养家种”的政策方针，该场于1958年建立，在建立之初，从野外逮捕林麝进行科学研究，在养殖到一定时期，停止从野外抓捕林麝进行驯养。据统计，在1992年，场内养殖林麝数量仅为142头，并在此基础上进行长达20多年的封闭繁育状态，导致其遗传漂变缺失。

因此，在对林麝毛发进行多态性检测时，未能检测出IGF-1基因的多态位点，究其原因，应该与群体内部近亲繁殖有密切关系。虽未能检出IGF-1基因的多态位点，不能对其产仔性能进行标记选育，但是为林麝产香性能的分子遗传标记选育提供了基本思路。