miR-155对结肠癌细胞增殖及线粒体凋亡信号通路的影响

李 涛，宛迎春，苏子源，周长玉*

(1.吉林大学中日联谊医院 消化内科，吉林 长春130033；2.长春中医药大学附属医院)

结直肠癌是男性中最常见的3种癌症之一，也是女性最常见的两种癌症之一。全球平均每年有100万人被诊断出患有结直肠癌[1]。死亡率随疾病分期有显著差异;有5年以上的存活率90%的I期患者，10%-20%的转移患者[2]。结直肠癌存在的类型多样，约40%的病例携带KRAS突变，10%为BRAF突变[3]。与野生型KRAS患者相比，突变的KRAS预示着不良的预后和生存，同时耐受抗表皮生长因子受体(EGFR)治疗[4-6]。

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在全球恶性肿瘤发病率中居第三位，在癌症相关死亡中排名第四，严重危害全球范围内居民健康，给社会和家庭经济造成沉重负担[1]。结肠癌的主要危害来源于术后的复发和转移，特别是晚期结肠癌患者，如何预防和降低转移成为治疗结肠癌的关键[2]。

microRNAs (miRNAs)是一类内源性转录调节RNA分子，长度约22个核苷酸，参与动植物转录后基因表达调控[3,4]。近来的研究显示，miRNA与肿瘤的发生发展密切相关，通过对目标基因的调节，参与肿瘤细胞生长，增殖和转移的调节[5,6]。本课题拟通过实验明确miR-155对结肠癌细胞增殖和线粒体凋亡信号通路的影响，为临床治疗结肠癌提供新的策略和作用靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

结肠癌组织和癌旁组织收集于吉林大学中日联谊医院，人结肠癌HCT116，SW480细胞和人结肠上皮细胞NCM460购买于中国科学院细胞库.细胞培养用胎牛血清FBS和DMEM高糖培养液购买于美国GIBCO公司，1640培养液和细胞消化用胰酶购买于美国Hyclone 公司。miR-155 inhibitor和对照购买自上海吉玛制药技术有限公司，Bax和cytochrome C抗体购买自美国CST公司。

1.2 RT-qPCR

利用Trizol试剂方法提取细胞中总RNA，提取总RNA后利用TaqMan进行实时逆转录聚合酶反应(RT-PCR)，miR-155所用引物和内源性对照U6购买自上海吉玛制药技术有限公司，利用ABI 7300检测系统对结果进行检测。

1.3 细胞转染

利用lipofectamine3000进行细胞转染，细胞培养至80%进行细胞转染，将细胞培养液换成Opti-MEM培养液，利用Opti-MEM稀释lip3000和DNA，同时在DNA溶解液中加入P3000，室温孵育10 min，滴入已经换成Opti-MEM的平皿中，转染5 h后，换成正常细胞培养液，24 h后进行相应实验。

1.4 CCK8检测结肠癌细胞增殖率

细胞生长至对数生长期后，进行细胞传代，计数，铺96孔板，按照每孔2000个细胞进行铺板，铺板后过夜等待细胞完全贴壁后进行不同分组作用。按照不同的分组作用细胞，观察细胞状态完成相应的作用，待作用时间完成后，每孔加入10 μl CCK8溶液，轻轻混匀，放入浮箱内继续培养3 h后停止作用，利用酶标仪检测吸光度值(OD值，450 nm)。

1.5 Western Blotting检测结肠癌细胞内蛋白表达

蛋白是细胞内发挥生物学功能的大分子物质，检测蛋白水平的改变可以反应细胞内一些现象的发生，细胞蛋白提取和表达检测步骤如下，将对数生长期的细胞按照分组进行分皿，待细胞完全贴壁后进行相应的处理，处理完成后进行蛋白的提取，弃除细胞正常培养液，冷却的PBS洗细胞2次后，完全吸出PBS，加入150 μl RIPA细胞裂解液，均匀铺开后，放置冰上作用5 min后，利用细胞刮将细胞完全刮除后转至EP管中，放入4℃冰箱摇匀作用30 min，3 000 rpm/min离心20 min，取上清后对蛋白浓度进行定量(BCA方法)。根据蛋白浓度绝对上样体积，蛋白中加入loading buffer，95℃煮蛋白使其变性后，进行蛋白质丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量的蛋白，将胶上的蛋白通过转模转移至PVDF膜上， 5%脱脂奶粉中封闭2 h，根据检测蛋白的不同加入相应的一抗，低温孵育过夜，第二天PBST清膜3次后加入相应的二抗，室温孵育2 h后， PBST清膜3次， ECL发光显示，对结果进行拍照分析。

1.6 流式细胞仪检测不同分组结肠癌细胞凋亡率

利用流式细胞术检测不同分组下结肠癌细胞的凋亡率，利用Annexin V-FITC/PI双染色检测凋亡率的改变。具体步骤如下，将对数生长期的细胞按照分组进行分皿，待细胞完全贴壁后进行相应的处理，药物作用完成后，消化收集细胞，利用冷PBS清洗细胞2次后加入染料Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用0.5 h，利用流式细胞术进行荧光强度的检测。

1.7 统计学方法

对CCK8，流式细胞术和western blotting数据结果进行统计分析。利用SPSS 16.0统计学软件进行分析，两组比较采用t检验的方法，3组及3组以上采用方差分析的方法，P<0.05定义为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织与癌旁组织中miR-155表达水平

为明确miR-155在结肠癌组织中的表达，我们首先利用了RT-qPCR的方法检测了30对组织中miR-155表达水平，结果显示，与癌旁组织相比较，结肠癌组织中miR-155表达水平明显升高，差异具有统计学意义，见表1。

表1 RT-qPCR检测结肠癌和癌旁组织miR-155表达水平

*与癌旁组织相比较有统计学差异，P<0.05

2.2 miR-155 抑制剂对结肠癌细胞增殖率的影响

在检测到miR-155表达水平上调的基础上，我们进一步探讨抑制miR-155对结肠癌细胞增殖率的影响，我们检测了HCT116和SW480两种结肠癌细胞。结果发现，转染miR-155抑制剂可以明显的降低两种结肠癌细胞的增殖速度，见图1和图2。

图1 miR-155 抑制剂对HCT116细胞增殖率的影响

图2 miR-155 抑制剂对SW480细胞增殖率的影响

2.3 miR-155 inhibitor对结肠癌细胞凋亡的影响

我们进一步检测了miR-155抑制剂其两种结肠癌细胞凋亡率的影响，我们利用流式细胞术检测了给予miR-155 inhibitor对凋亡率的影响，结果发现，与对照组相比较，miR-155 inhibitor可以明显的增加两种结肠癌凋亡率，差异具有统计学意义，结果见表2。

表2 miR-155 inhibitor对HCT116和SW480细胞凋亡率的影响

*与Control组比较，P<0.05

2.4 miR-155 inhibitor对结肠癌细胞线粒体凋亡相关蛋白表达的影响

研究显示，线粒体凋亡信号通路在凋亡的发生中发挥了重要的作用，因此我们进一步检测了线粒体凋亡相关蛋白Bax和Cytochrome C表达水平。Western Blotting结果发现，给予miR-155 inhibitor可以明显的增加细胞中线粒体凋亡相关蛋白Bax和Cytochrome C表达水平，结果见图3和图4。

图3 miR-155 inhibitor对HCT116和SW480细胞Bax表达水平的影响

图4 miR-155 inhibitor对HCT116和SW480细胞Cytochrome C表达水平的影响

3 讨论

结肠癌是男性和女性中第三常见和第二致命的恶性肿瘤,结肠癌具有很强的环境关联性和遗传风险因素[7]。大约5%的结肠癌是由家族性腺瘤性息肉病和林奇综合征两种遗传综合征。正常结肠的演变成癌前病变和浸润性癌需要大约10到15年通过遗传的积累突变体(获得的)和/或生殖系(遗传的)。染色体不稳定性、失配修复和CpG高甲基化是结肠癌发生的主要途径。病理诊断是最重要的结肠癌预后指标[8]。大量的证据表明了miRNAs与肿瘤的密切关系，成为肿瘤诊断和靶向治疗的热点分子[9]。近来的报道显示出miRNAs家族成员miR-155在多种肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用[10]。但是，在结肠癌的发生，细胞增殖以及凋亡中miR-155是否发挥了重要作用还不是很清楚，基于此本课题组开展了本次实验。

首先检测了临床组织样本中miR-155表达水平，结果发现，与癌旁组织相比较，结肠癌组织中表达水平明显的升高。为明确miR-155对细胞增殖率和凋亡的影响，我们利用miR-155 inhibitor检测其对结肠癌细胞增殖率和凋亡率的影响，结果发现，抑制miR-155可以明显的降低结肠癌细胞的增殖率，增加细胞凋亡的发生，提示miR-155参与了结肠癌细胞增殖和凋亡的调控。

凋亡是细胞内普遍存在的生物学过程，同时是癌症治疗过程中抗癌试剂盒药物诱导细胞死亡的主要方式[11]。多种信号通路都可以介导细胞凋亡信号通路，其中线粒体凋亡信号通路是最常见的，也是在肿瘤细胞凋亡中发挥主要作用的信号通路[12]。Bcl-2家族蛋白在线粒体凋亡信号通路中发挥重要作用，特别是Bax，其在线粒体外膜形成孔道，促进线粒体内膜和外膜间的cytochrome C释放到细胞质中，促进了凋亡的发生[13]。

为进一步明确线粒体凋亡信号通路在miR-155抑制剂介导结肠癌细胞凋亡中的作用，我们检测了线粒体凋亡相关蛋白Bax和cytochrome C，结果发现，两种表达水平明显的升高，提示线粒体凋亡信号通路参与了miR-155 抑制剂诱导的结肠癌细胞凋亡。

综上所述，miR-155在结肠癌组织中呈现高表达，抑制miR-155可以引起结肠癌细胞增殖率的下降和凋亡的升高，线粒体凋亡信号通路参与了凋亡的发生过程。本课题为临床治疗结肠癌提供了新的思路和治疗靶点。

作者简介：周长玉,吉林大学中日联谊医院消化科主任医师.