龋病微生态改善疗法的研究进展

孙婧宇，李艳红

(昆明医科大学附属口腔医院口腔预防科，昆明 650106)

龋病是最常见的口腔疾病之一，是一种由口腔内多种因素复合作用于牙齿硬组织而导致的慢性进行性疾病，发病率高，分布广泛。世界卫生组织已将龋病与癌症以及心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。数百万年来，微生物和人体通过相互适应和功能整合构建了一个完整的“超级有机体”[1]。这一进化过程产生了一个高度选择、多样化的口腔微生物群[2]。大约有700种口腔细菌已被鉴定出来，其中50%尚未被培养出，有些仅通过DNA序列发现。口腔微生物群与宿主相互作用、相互依赖，在微生态环境中共同构成微生态系统[3]。早在1994年Marsh等[4]就提出了“生态菌斑学说”，即口腔微生态系统通过能量流动、物质循环以及基因传递保持口腔微生态的动态稳定。然而，当微生态环境中关键因素改变，致使某些条件致病菌竞争性生长，口腔稳态被打破，原有的低致龋菌群转化为高致龋菌群，导致龋病发生。微生态改善治疗是指通过促进有益菌、抑制致病菌生长和繁殖使口腔微生态重新恢复平衡的治疗方法[5]。现就龋病微生态的主要研究方法和微生态改善疗法的研究进展予以综述。

1 口腔微生物研究方法

从病因学来说，龋病是口腔微生态失衡导致的疾病。因此，龋病的研究必须从口腔微生态开始。口腔是人体中最复杂、最活跃、最多样的微生物聚集地之一，也是公认的最古老的微生态系统。口腔微生物群易于取样，是人类研究最多的微生物群，一般可作为微生物学研究模型。对口腔微生态进行研究有助于更清晰地阐明口腔微生态中各细菌相互作用的机制，并有助于研究治疗和预防龋病的潜在途径。口腔微生物研究方法是进行口腔微生态研究的基础，研究方法的不断改进也为微生态研究提供了便利和依据。

细菌的分离培养一直是口腔微生物研究的基础。但因口腔是一个开放的生态系统，细菌的数量和种类受外界环境影响，且大量细菌无法培养，所以到目前为止仍有1/3～1/2的口腔微生物尚未被培养出来[6]。近年来，得益于现代分子生物学和生物化学的发展，口腔微生物群的组成和结构逐渐被学者所了解。口腔微生物群的研究方法有很多种，其中最主要的是传统平板分离培养法和现代分子生物学法。

1.1传统平板分离培养法 传统平板分离培养法是采集唾液、龈沟液或牙菌斑等样本后，在实验室将样本进行稀释、接种和培养，随后对培养出的菌落进行形态学观察、分离纯化以及生理生化鉴定。

据估计，地球上99%以上的细菌尚未在实验室培养出来[6]。现在已经分离、培养、鉴定、描述和分类了约350种人类口腔中定植的细菌，但仍有50%的口腔细菌无法在实验室培养[7]。口腔内细菌的培养需要不同的条件，如培养环境、培养温度、化学培养基、细胞因子等。尽管目前实验室已尽可能地满足这些条件，但很多口腔细菌仍然无法以常规的方式培养出来，可能是因为它们与其他有机体有特殊的代谢联系[8]。除此之外，缺乏某些特殊营养素或生长因子、培养基毒性、细菌感应以及其他信号系统的破坏或其他未知原因也导致许多菌种无法在体外进行培养。口腔细菌并不是孤立地生活在生物膜的复杂群落中，它们之间具有协同和拮抗作用，相互依赖得以生长和生存[9]。传统平板分离培养法在揭示口腔微生物组的多样性方面具有明显的局限性，已渐渐无法满足口腔微生物群组成和结构研究的需求，但其在微生物的分类及鉴定中仍非常重要。

1.2现代分子生物学分析方法 现代分子生物学是一种可以直接对环境微生物进行分析，通过检测和分析从微生物群落中提取的核酸或蛋白质，实现对微生物群落多样性和功能性的研究。目前常用的现代分子生物学分析方法主要有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和高通量测序技术。

FISH是一种核酸探针杂交技术。基本原理是将带有荧光标记的探针与特异的互补序列杂交，通过对激发荧光信号进行检测以鉴定和定量分析特异性微生物[10]。激光扫描共聚焦显微镜常与FISH结合用于研究完整的生物膜，以提高对微生物群落空间关系及其变化的分析能力。使用FISH和激光扫描共聚焦显微镜可以从剩余牙菌斑生物膜厚度、不同层面菌斑图像、三维立体结构、死菌和活菌的数量及百分比、细菌活性等方面观察牙菌斑的变化[11]。

高通量测序技术即新一代测序技术，是测定DNA分子中核苷酸精确顺序的方法，其特点是通量高、耗费小，可一次进行几百万条单独DNA分子的测序，且无需提前克隆及图谱制作。新一代高通量测序技术为认识微生物群落的结构及功能、组成及丰度等的差异等起到了重要作用[5]。李莹和仪虹[12]采集10例无龋和10例高龋受试者的唾液样本，提取样本细菌总基因组DNA，然后进行16 Sr DNA的聚合酶链反应扩增和454焦磷酸测序,结果显示，不同个体之间唾液菌群结构差异较大，高龋组较无龋组有更高的微生物多样性，但两组拥有共同的核心微生物。该研究认为，龋病不是由某些特定致病微生物造成的，而是口腔微生物群落结构的多样性及其变化导致的。

2 龋病的微生态改善疗法

生态菌斑假说是为解释龋病的病因而提出的，其总结了口腔微生态环境的动态变化。研究发现，很多口腔疾病是由口腔微生态失调引起的，并且口腔疾病也会引起微生物环境的改变[4]。目前已经认识到采用合适的方法调整口腔菌群平衡是预防和治疗各种口腔疾病的关键，同时提出了微生态改善治疗。微生态改善治疗的目标是恢复微生态的平衡，目前主要用于胃肠道疾病的治疗和预防。微生态改善治疗从针对特定物种到替换整个微生物区系都有涉及。目前针对口腔微生态的改善疗法主要有免疫策略、益生菌疗法以及中药防龋。

2.1免疫策略 早在19世纪60年代，国外学者就开始了防龋疫苗的研究，期望通过接种某种防龋疫苗以阻止致龋菌在口腔中的黏附和定植，达到调节口腔微生态平衡、预防龋病的目的[13]。龋病的免疫学预防主要分为主动免疫防龋和被动免疫防龋。主动免疫是将抗原性物质人工接种到机体上，刺激机体免疫系统产生免疫应答，以提高机体的抗病能力。主动免疫防龋方法主要有全菌细胞抗原免疫、重组细菌抗原免疫、抗原分子免疫等。被动免疫是指给机体输注外源性免疫效应物质、致敏淋巴细胞后获得的特异性免疫能力。被动免疫防龋方法主要有转基因植物免疫、多克隆抗体、单克隆抗体防龋等。

1993年，Parkash等[14]对171例儿童的患龋情况与细胞介导的免疫应答情况进行了研究。收集研究对象的淋巴细胞进行体外培养，用变异链球菌作为抗原刺激物观察淋巴细胞的变形程度，得出刺激指数。结果显示，与高龋儿童相比，低龋儿童刺激指数较高；在龋病的不同阶段，细胞介导的免疫应答具有调节保护作用。Simón-Soro等[15]利用荧光标记和流式细胞术标记特异性抗体发现，免疫球蛋白A是影响龋病危险性的重要因素，患龋唾液与无龋唾液中免疫球蛋白A的比例比较差异有统计学意义。唾液抗体和其他保护性成分对牙釉质的免疫应答发挥重要保护作用。

在预防龋病方面，被动免疫和主动免疫均取得了较好的效果，但这些方法仅是以变异链球菌的表面抗原为基础[16]。研究证实，龋洞内的微生物群落具有高度多样性，变异链球菌在整个龋洞微生物群落中所占的比例不到1%[17]。此外，与龋病有关的微生物群落存在较大的个体差异，即使是同一个体不同龋损区的细菌活跃性也有较大差异[18]。因此，单一物种或单个表面抗原用于主动和被动免疫具有一定的局限性[19]。此外，全菌细胞抗变异链球菌抗体可与机体某些组织蛋白发生交叉反应，从而产生免疫复合物介导的疾病，如细菌性心内膜炎。变异链球菌与其他口腔链球菌有交叉反应性抗原,所以防龋疫苗介导的免疫反应可能会破坏口腔正常菌群的生态平衡[20]。

2.2益生菌疗法 益生菌是一种当给予足够剂量时有益于宿主健康的活的微生物[21]。益生菌疗法是指用益生菌替代病原微生物，以恢复微生态平衡的方法[22]，目前多用于防治消化系统的菌群失调。口腔是消化系统的起始端，龋病是一种口腔菌群失调导致的疾病。有学者提出，将益生菌疗法运用于口腔可达到预防龋病的目的[23]。乳杆菌和双歧杆菌是最主要的两种益生菌，对链球菌和念珠菌的生长有抑制作用[24]，作用机制包括改变口腔内pH，产生抗菌化合物对抗病原体，竞争病原体结合和受体位点，刺激免疫调节细胞产生免疫反应等。Aminabadi等[25]给予105名儿童含有鼠李糖乳杆菌GG株的酸奶后，口腔致龋菌的数量明显下降。Jindal等[26]的研究证明，食用益生菌片剂可使变异链球菌的数目显著下降。但也有学者认为，益生菌对致龋菌无抑制作用，有些益生菌甚至会加速龋病进程[27]。一项随机双盲对照试验发现，干酪乳杆菌F19对变异链球菌等致龋菌无抑制作用，且干酪乳杆菌F19也未在口腔中定植[28]。Cildir等[29]发现，儿童服用罗伊乳杆菌后致龋菌变异链球菌和乳酸杆菌的数量并未减少。Schwendicke等[30]通过体外实验发现，鼠李糖乳杆菌不但不能抑制变异链球菌的生长,反而诱导牙本质脱矿加速，导致龋病加重。

近年来一些口腔新物种被分离出来，包括链球菌A12[31]和S.dalsani[32]，其兼具抗菌和抗酸的功能。这些口腔微生物较传统乳制品或肠道相关益生菌更佳，虽然在口腔中的定植能力有限，但能发挥更多潜在的有益功能。因此，接种这些潜在的有益的口腔微生物或通过使用刺激其生长和有益功能的益生元以调节口腔微生态平衡的研究受到越来越多的关注，目前正在进行临床试验以研究其在人体口腔中的定植能力和改善口腔健康方面的效果。

除上述益生菌外，益生元对调节口腔微生态平衡也有一定的作用。精氨酸是一种合适的益生元。临床研究表明，在牙膏中添加适量精氨酸可显著改善有低度到中度龋病风险人群的患龋情况[33]。在体外实验中，精氨酸对口腔微生态的调节具有积极作用[34]。目前关于其他益生元对口腔健康的潜在作用的研究依然非常有限。

2.3中药防龋 使用中药预防龋病是当前研究的热点。中药预防龋病的机制主要有两方面：①对牙体组织再矿化的作用；②抑制致龋菌黏附，影响牙菌斑生物膜的结构。

动物研究发现，五倍子可有效抑制变异链球菌在细菌生物膜中的生长，抑制菌斑中致龋微生物的活性[35]。厚朴酚可以抑制变异链球菌的黏附、生长以及产酸，还可影响细菌生物膜的结构和致龋菌的活性[36]。茶叶中具有防龋作用的成分是茶多酚。茶多酚可抑制致龋菌生长，减少变异链球菌附着，降低变异链球菌葡糖基转移酶的活性，可有效调节口腔微生态平衡[37]。除此之外，白芨、黄苓、丁香、大黄、虎杖、柠檬、蜂胶等均具有不同程度的抑制致龋菌黏附、生长、产酸的作用[38]。但以上研究多在体外进行，在体内，尤其是在复杂的口腔微生态环境中，中药是否还可以发挥调节微生态平衡的作用尚无结论。

3 小 结

近年来，使用现代分子生物学分析技术和显微镜技术的口腔微生态研究受研究成本和检测方法的限制，通常样本数量较少，导致这些研究有很大的局限性。随着研究方法的不断改进，口腔微生态的多组学研究也得到长足的发展。目前大部分的口腔微生物研究都集中在细菌多样性上，忽视了口腔中真菌和病毒对口腔微生态的调节作用[39]。未来应加强对病毒和真菌在口腔中作用的研究。

在临床实践中，龋病的治疗通常被理解为以恢复牙齿结构、功能和美学要求为基础的牙体硬组织的修复。但这并不是对龋病本身的治疗，而是对其后果的治疗。此外，口腔微生物群具有个体差异性，患龋由遗传和口腔微生态环境共同决定[40]。防龋的目标是采取相应的预防或治疗措施调控影响龋病发生的多种因素，恢复口腔微生物稳态，进而控制龋病进展，恢复牙齿的结构和功能。研究表明，无论是免疫策略、益生菌疗法还是中药防龋都可以在一定程度上阻碍致龋菌的黏附、定植和生长，调节口腔微生态平衡，达到有效防龋的目的[41]。尽管防龋研究已取得了一些成果，但这些种方法均存在一定的缺陷，甚至有研究认为这些方法并不能达到防龋的目的，有时还会导致口腔微生态紊乱[6]。因此，尚需深入研究各种调节口腔微生态平衡的防龋方法的作用机制，并进行长期、大样本的临床试验以观察防龋方法的效果。