胶质瘤干细胞在肿瘤微环境中代谢调控的研究进展

许智星，陈 希，李炫辰，柯 雨，刘旭杰，田锦涛，蒲 军

(昆明医科大学第二附属医院神经外科，昆明 650101)

2016年世界卫生组织将胶质瘤的分子和组织学特征整合起来形成新的分类，即弥漫性胶质瘤和非弥漫性胶质瘤，前者包括由异柠檬酸脱氢酶突变和染色体1p/19q编码的星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，后者包括毛细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞性星形细胞瘤[1]。目前的治疗主要手段是致力于实现最大化的手术切除，同时使用替莫唑胺化疗和放疗。自1965年起，治疗进展甚微，复发率高，对放化疗耐受性强，中位总生存率仅12～15个月，5年生存率仅为5%[2-3]。近年来研究发现，胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)在微环境中能通过调控超音速刺猬蛋白-神经胶质瘤相关癌基因同源物1、成纤维细胞生长因子2、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinas B，PI3K/Akt)、细胞外调节蛋白激酶1/2等信号通路促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、免疫逃避，推动肿瘤血管形成、复发、异质性的形成以及对术后放化疗的高耐受性。现就GSCs及其在微环境间的代谢调控机制进行综述。

1 GSCs的特点

GSCs是一类具有较强自我更新、无限增殖能力和多向分化潜能的与神经干细胞类似的细胞群，研究表明该肿瘤细胞群可以在用生长因子(如表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)取代且无血清干细胞培养基中形成神经球，自我更新，并能表达正常的细胞标记，在放化疗抵抗和肿瘤复发过程中起关键作用[4]。作为胶质瘤的重要起源细胞，GSCs与分化的肿瘤细胞相比具有明显不同的代谢表型，并且可能容易地根据微环境在糖酵解和氧化代谢之间切换。这也表明，GSCs可以抛开肿瘤自身的代谢特征，更多地依靠自身代谢适应和重编能力进行藏匿或分化。

2 GSCs代谢

GSCs在体外研究证实具有自我更新能力，能分化成多种细胞谱系，形成神经球并表达特定的标志物，如巢蛋白、转录因子Sox2、CD133抗原等[5-6]。与大多数癌症干细胞相同，GSCs在不同的代谢条件下具有很强的可塑性和适应力。如在放疗过程中，大多数癌症细胞在辐射下死亡，而GSCs可以保持不受压力的影响进入细胞周期，迅速增殖促进肿瘤复发[7]。此外有研究显示，正常细胞在葡萄糖和氧气充足的情况下，将大部分发生氧化磷酸化，但在肿瘤干细胞中，即使在氧气充足的条件下，大部分葡萄糖也会自动从线粒体中转移，而细胞本身则进入糖酵解途径，产生乳酸。这种代谢适应可以在提供用于基础瘤细胞繁殖和生长的必要资源的同时，维持肿瘤自身足够的平衡性，适应来自细胞内外的各种压力[8]。

3 GSCs的微环境

GSCs的高适应性和可塑性能帮助其在恶劣条件下生存，同时也提示一个重要的线索，即维持细胞干性、代谢可塑性发挥的必要条件：干细胞微环境。与大多数干细胞相同，GSCs与其所处微环境壁龛之间的关系非常密切。目前，周围血管壁龛[9]，小动脉周围壁龛[10-12]，周围缺氧壁龛[13]，周围免疫壁龛[14]和细胞外基质壁龛[15]在GSCs中均被证实。每种类型的壁龛都含有特定的细胞类型和蛋白质，这些细胞类型和蛋白质负责特定的分子机制，如在GSC周围血管壁龛中，GSCs与血管内皮细胞密切相关[16-17]。在小动脉周围壁龛中，已发现蛋白质如基质衍生因子-1α及其受体C-X-C受体4型位于血管内皮细胞周围[10-12]。在周围缺氧的情况下，缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)在干性调节中非常重要，但HIFs的表达在血管周围壁龛和小动脉周围壁龛中也非常重要[18-19]。在免疫周围壁龛中，GSC已被证明能诱导骨髓来源的单核细胞和小胶质细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞[19-20]。在细胞外基质壁龛中，已经鉴定出在血管生成过程中起关键作用的标志物。每种类型的壁龛都包含细胞、蛋白质和(或)分子机制的类型，这些细胞、蛋白质和(或)分子机制在某些情况下是特定类型的壁龛中所特有的，但可在不同环境条件下在不同的壁龛之间共享[15,21]。

4 微环境中的代谢调控

近年来研究显示肿瘤微环境不仅通过血管重塑和低氧介导的信号通路促进GSCs保护性壁龛的发展，各壁龛及代谢产物还存在双向代谢调控过程，如肿瘤干细胞能通过上皮-间质转化的途径，从细胞外微环境中获取丙酮酸盐、乳酸盐、谷氨酰胺、丙氨酸和(或)酮体等多种代谢物以保持线粒“燃料”供给[22]。有研究表明肿瘤微环境与肿瘤细胞之间的线粒体DNA存在交换机制，目的是支持已损害或呼吸功能较弱的GSCs，并且增强自我更新能力以及GSCs的治疗耐受性[23]。这说明GSCs不仅可以交换或内化新陈代谢的营养物质，还可以内化线粒体的能量生成元素以支持其自身的代谢需求，并通过增加细胞毒性和降低抑制性细胞功能逆转免疫抑制，实现免疫应答。

4.1能量代谢调控

4.1.1糖代谢 在正常大脑中，星形胶质细胞主要通过糖酵解产能，而神经元依赖于氧化磷酸化[24-25]。与正常细胞相比，即使在氧充足的条件下，GSCs仍主要通过糖酵解产能[8]。一般情况下，有氧糖酵解在生产ATP方面的效率低于氧化磷酸化，因此有学者推测，有氧糖酵解使肿瘤细胞能够产生其他生物合成途径的前体[24-25]。在原位肿瘤模型中，13C标记的乙酸盐和葡萄糖在三羧酸循环中显示出乙酸盐利用率更高，表明乙酸盐是三羧酸循环的主要来源，而来自葡萄糖中的碳则被利用到其他生物合成途径，同时将葡萄糖转化为乳酸，以满足快速增殖肿瘤细胞的能量所需[26]。另一项研究表明，GSCs中的葡萄糖用来维持嘌呤的合成，证实糖代谢可以为其他合成代谢过程提供中间产物和碳源[27]。但Vlashi等[28]根据细胞外酸化率，耗氧量和乳酸产量研究发现，在常氧条件下，GSCs的糖酵解程度低于非GSCs。这两种不同的研究结果说明GSCs具有改变其代谢特征以适应环境和生存的能力。

葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，GLUT)家族在葡萄糖转运中具有重要作用，但它们也可以运输包括果糖、甘露糖、半乳糖和(或)葡糖胺在内的其他底物。已知的GLUT 1,2,3,6,8,10和13均在大脑中表达，其中以GLUT1和GLUT3的表达最为显著[29-31]。GLUT1对血糖跨血脑屏障的运输至关重要，GLUT1经缺氧/HIF1-α调节，使缺氧区域内的细胞通过摄取增加的葡萄糖水平而保证自身生存[32]。与GLUT1相比，GLUT3是神经元GLUT且具有增加葡萄糖亲和力的作用。GLUT3的调节因子包括HIF和核因子κB，其表达高低与多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)和许多其他实体癌预后相关[32-33]，GSCs可以通过PI3K/Akt途径，调控GLUT3的表达并促使其向细胞表面转移以促进有氧糖酵解。研究表明[34]，Akt还将己糖激酶2募集到线粒体，使其依环境不同选择性进行糖酵解和氧化磷酸化两种代谢方式，防止细胞凋亡。此外，PI3K和Akt可将葡萄糖中的碳转运给其他生物合成途径，敲除GSCs中的GLUT3可降低体外和体内GBM的生长[35-36]。

线粒体是细胞呼吸产生能量的主要场所，胶质瘤研究中已报道过多种线粒体功能障碍的情况，如结构异常、代谢改变、线粒体DNA突变等[37]。有报道指出，多数情况下肿瘤干细胞线粒体DNA水平较低，分化后细胞内DNA复制数量则明显增加[8]。Xie等[38]也通过细胞周期蛋白依赖性激酶5激活发动蛋白相关蛋白1证实，与非GSCs相比，GSCs中线粒体分裂增加。然而，也有研究表明与分化后细胞内的线粒体相比，虽然肿瘤细胞内的线粒体数量少，但其体积大，质量重，在有效增加线粒体膜电位，增加线粒体活性氧类的同时也增强耗氧率。体积增大的线粒体也被证实与肿瘤干细胞DNA损伤耐受性高度相关[39]。这也说明即使在低氧条件下，肿瘤干细胞也能利用较少的氧气满足自身的代谢需求；但这并不意味着GSCs抗氧化能力弱，相反，虽然GSCs中的线粒体具有较高的活性氧类水平，但瘤体细胞内总的活性氧类水平较低，恰恰反映出GSCs能有效利用抗氧化机制，不仅有助于维持GSCs的干性，还能保持对治疗高耐药性；实验表明即使阻断线粒体代谢，结果仅迫使其切换至加大糖酵解途径的效果，仍然具有非常高的代谢可塑性[34]。

4.1.2脂代谢 尽管GSCs中大量研究都集中在糖代谢上，但越来越多的研究表明[40-44]，其通过改变脂肪酸氧化所需酶的表达，参与脂代谢的调控。肉碱棕榈酰转移酶1A和肉碱棕榈酰转移酶1C分别是长链脂肪酸转运到线粒体和脂肪酸β氧化的调控剂，GSCs可以通过对这两种酶的调控进而调节瘤体自身的产能[40]。研究表明，肉碱棕榈酰转移酶1A和肉碱棕榈酰转移酶1C在胶质瘤患者中均高表达，且用肉碱棕榈酰转移酶抑制剂作用于GSCs，能降低细胞总数和增殖细胞百分比[41]。此外，GSCs可以上调极长链酰基辅酶A合成酶同源物3的表达，将辅酶A添加到脂肪酸中，用于满足其他代谢途径的需求，Sun等[42]和Pei等[43]通过实验证实，酰基辅酶A合成酶同系物3的缺失降低了GSCs中CD133、Sox2的表达，导致胶质瘤异种蛋白在动物模型中不能繁殖成瘤。对于胆固醇，GSCs可以通过调控合成胆固醇所需的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶增强肿瘤细胞对其摄取[44]。

4.1.3氨基酸代谢 在低氧条件下，肿瘤细胞依赖高水平的谷胱甘肽维持氧化还原稳态，以应对氧化还原应激水平的增加，研究表明胶质瘤增加游离氨基酸含量以支持谷胱甘肽生成，还发现蛋白质分解代谢和自噬增加的证据，这与慢性缺氧引起的自噬和蛋白质降解增加情况一致，表明缺氧细胞中谷胱甘肽合成增加[45]；同时，在低氧条件下GSCs依靠其调节谷胱甘肽的能力可能导致GBM细胞对化疗和放疗更具耐药性[46]。天冬酰胺是癌细胞凋亡耐药性的另一种氨基酸。Karpel-Massler等[47]在GBM中使用大肠埃希菌衍生的L-天冬酰胺酶处理GSCs和源自患者的异种移植物，结果显示GBM模型的子集减少，表明L-天冬酰胺酶可以促进胶质瘤细胞凋亡，然而GSCs可以通过天冬酰胺合成酶的上调获得对L-天冬酰胺酶的耐药性。此外，赖氨酸也被认为是癌症的潜在生物标志物。赖氨酸分解代谢可通过糖蛋白途径和管道途径进行，糖蛋白途径主要用于发育中的大脑，而管道途径通常用于成年大脑。研究证实GSCs可通过上调赖氨酸分解代谢中间体α-氨基己二酸，继续通过糖蛋白途径调控赖氨酸代谢，随后的检测也证实，α-氨基己二酸的表达与患者生存率相关[48]。

4.2免疫代谢调控 小胶质细胞和髓源性巨噬细胞代表两种具有相似免疫调节作用的细胞群，因刺激因素不同，胶质瘤相关的小胶质细胞/巨噬细胞(glioma-associated microglia/macrophages，GAM)既可以活化为促炎作用更强的M1样表型，也可以活化成以抗炎为主的M2样表型[49-50]，在胶质瘤组织中，检测到大量M2相关抗炎因子,如转化生长因子-β、白细胞介素-6、白细胞介素-10等，仅检测到少量M1相关促炎因子,如γ干扰素、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-2等[51-52]。研究表明GSCs诱导GAM活化为M2样表型可促进肿瘤的生长、迁移、侵袭，同时GAM促进细胞外基质的分泌，既能表达VEGF促进新血管生成，还能促进GSCs中壁龛因子的表达，形成有效循环机制，为免疫抑制微环境提供重要帮助[53]。

单核细胞趋化蛋白-1是GAM最主要的化学诱导物之一，单核细胞趋化蛋白-1能促进新生血管生成和调节性T细胞的浸润，增强肿瘤细胞增殖及侵袭能力，其表达程度与胶质瘤等级相关，而GSCs通过表达单核细胞趋化蛋白-1、VEGF、基质衍生因子-1α等生长因子和化学引物蛋白，将GAM募集到缺氧壁龛中以促进肿瘤发展[52,54-55]。

调节性T细胞是机体最重要的免疫抑制细胞，研究证实能将肿瘤浸润性T细胞转移到肿瘤保护性调节性T细胞中诱导免疫抑制表型[56]。白细胞介素-10可通过抑制抗原呈递细胞、调控T细胞增殖、调节性T细胞等诱导免疫抑制表型[57-59]，而目前研究认为白细胞介素-10主要来源于GAM通过信号转导和转录激活因子3信号通路转录形成[58,60]。

GSCs可以去分化形成内皮细胞和周细胞，相关研究表明，约60%的内皮细胞来源于GSCs[61]，血管内皮细胞在胶质瘤中可通过HIF-2α介导精氨酸酶1的表达，激活和促进GAM进入肿瘤，随后巨噬细胞活化并参与肿瘤的发展[62]。此外，GSCs分泌转化生长因子-β诱导M2型GAM极化，诱导抗原性调节性T细胞，抑制效应T细胞的增殖，适应免疫反应并强化GSCs的侵袭性[63]。研究证实，几乎所有GAM都表达膜结合的Fas配体，而凋亡T细胞的特点是Fas受体表达，因此，有学者认为GAM通过Fas-Fas配体相互作用驱动活化T细胞的凋亡，从而进一步增强微环境的免疫抑制[64-65]。有研究显示，非经典Wnt(Wingless/Int1)通路配体Wnt5a是GSCs体内侵袭能力的关键条件因子，能通过调节参与细胞外基质金属蛋白酶的表达增强胶质瘤细胞的迁移和侵袭[66-68]。Hu等[66]通过转录组学和基因组学分析也表明，GSCs利用Pax6/Dlx5转录程序调节Wnt5a介导GSCs向内皮相细胞分化，反之，GSCs衍生的内皮样细胞产生Want5a促进宿主内皮细胞的聚集和增殖，该过程有利于肿瘤周围卫星病灶的形成，从而产生支持侵袭性胶质瘤生长的壁龛，最终导致肿瘤复发[66,69]。

4.3缺氧代谢调控 缺氧在任何关于代谢重编程和可塑性中均发挥重要作用。研究表明缺氧在体外可以促进神经球形成，并上调某些干细胞基因，如Sox2和Oct4。HIF-1α和HIF-2α是在缺氧环境下最关键的两个因子，HIF-1α可以通过调控PI3K/Akt和细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路增加肿瘤代谢，形成更多的神经球，促进肿瘤生长；然而，HIF-1α对于正常的神经干细胞功能也起关键作用，因此在这种矛盾的情况下，单纯性抑制HIF-1α可能达不到预期的治疗效果。HIF-2α则对GSCs功能和细胞“干性”维持更具有特异性。HIF-2α能稳定并增加干细胞特异性因子(如Nanog、Oct4和Sox2)的表达，尽管HIF-1α和HIF-2α在GSCs龛中均有表达，但在GSCs壁龛中HIF-2α的表达优于HIF-1α，HIF-2α可能是更为理想的治疗靶点[70-72]。此外，缺氧还促使肿瘤以糖酵解为主要代谢途径，由于高水平的乳酸产生并分泌到肿瘤空间，大多数肿瘤细胞都处于相对酸性的微环境中，研究显示肿瘤酸化不仅可以促进GSCs标志物表达和自我更新，同时GSCs通过自身旁分泌还能促进HIF-1α和HIF-2α在干细胞中的进一步表达，随后的体外实验显示，上调pH可影响HIF-2α表达，降低GSCs自我更新能力，说明酸性环境有利于维持肿瘤生长和耐药性[73]。

5 小 结

胶质瘤微环境是一个决定肿瘤进程的动态环境，虽然一直存在围绕GSCs假说的争议，但其与微环境间的相互作用在重塑、构建、促进胶质瘤的发生发展中起重要作用。这也是胶质瘤及其代谢特性的研究应着重基于微环境的前提下进行的原因。一旦将这些联系分开，关于细胞“干性”维持、代谢特征和信号通路依赖性等研究将不可避免地出现严重偏倚。

目前虽然有一套标准化的实验用于鉴定GSCs，但仍不清楚多个GSCs亚群是否存在不同的周围血管壁龛，是否具有不同的特征(慢速还是快速循环)以及每步关键信号通路如何发挥调控机制。因此，深入研究GSCs及其在微环境中的代谢调控机制具有重要意义，在提供实时有效理论基础的同时，也能为新治疗方案的研究提供新的途径和思路。