微RNA在骨肉瘤中的作用

刘果杭，谷文光，王 浩，赵子文，姜 博

(哈尔滨医科大学附属第一医院骨三科，哈尔滨 150001)

骨肉瘤也称为成骨肉瘤，是由间充质干细胞向成骨细胞的遗传和表观遗传分化引起的一种分化疾病，是儿童及20岁以下青少年人群中最常见的恶性骨肿瘤。由于骨肉瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织，其生长迅速，具有很高的组织破坏性和转移率。常用的治疗策略包括术前化疗或放疗、手术切除所有已知的病灶或转移性组织、术后处理，但预后仍不理想。寻找新的有效预防和控制措施来提高患者的生存率和生活质量，预防或延缓骨肉瘤的转移十分重要，因此，针对肿瘤形成及恶化过程中的特异性靶点进行基因治疗成为目前肿瘤治疗的新目标。

微RNA(microRNA，miRNA)是一类小的内生性的非编码单链RNA分子，长度为18～25个核苷酸，miRNA通过与目标mRNA的3′或5′端非编码区以碱基配对的方式结合，可以降解mRNA或阻滞翻译过程，导致相应基因的表达沉默，从而调节细胞内的多种病理生理活动，包括细胞周期的调控，细胞的生长与分化、凋亡以及胚胎发育等。另外，在人类已知的miRNA中，约有50%位于与肿瘤密切相关的染色体区域，表明miRNA在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中也发挥关键作用[1]。有研究发现，miRNA可以通过直接或间接地与靶蛋白结合从而发挥癌基因或抑癌基因的作用，如miR-30c可通过靶向SNAI114抑制食管鳞癌的进展[2]；miR-106b-5p可通过调控BTG315促进非小细胞肺癌细胞生长并抑制细胞凋亡[3]；miR-409-3p已被报道可以通过阻断Fip200自噬来增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[4]；miR-Let-7a可以通过趋化因子受体7/促分裂原活化的蛋白激酶通路诱导上皮-间质转化介导前列腺癌PC-3细胞侵袭迁移等[5]。现对骨肉瘤相关的miRNA及其对骨肉瘤的调控通路及靶向治疗等进行综述。

1 抑癌分子miR-34a

miR-34a是肿瘤抑制基因p53的直接靶向miRNA，通过调控p53进而调控细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡及其他生理活动。miR-34a在结直肠癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤组织和细胞中表达下调，且过表达miR-34a可以抑制多种肿瘤的生长、侵袭和转移能力。Avilion等[6]的研究表明miR-34a可以通过靶向调节性别决定区Y盒2翻译水平诱导多能干细胞并且利于干细胞的干性维持，Wang等[7]发现miR-34a可以作用于肿瘤干细胞的分化、维持及转移。

目前，有关miR-34a在骨肉瘤中的作用机制研究成为骨肉瘤治疗的新方向，旨在发现治疗的潜在靶标及诊断的生物标志物。唐静等[8]通过转染miR-34a模拟物等方法证实miR-34a可以通过调控SOX2(sex determining region Y-box2)蛋白水平，调节骨肉瘤肿瘤干细胞的自我更新能力、成瘤性和迁移能力。Ponchon和Dardel[9]通过人骨肉瘤组织标本分析证实骨肉瘤组织中的miR-34a水平显著下调，Fire等[10]的研究通过在骨肉瘤细胞内强化表达miR-34a，发现其可以抑制骨肉瘤细胞增殖并抑制肿瘤的发生。王桂勇和方松青[11]的研究显示miR-34a的模拟物及抑制剂可分别抑制和促进人成骨肉瘤MG-63细胞生长增殖活性，提示miR-34a可能在骨肉瘤的发生、发展中起抑癌基因的作用。有研究显示miR-34a可通过靶向众多癌基因或促癌因素发挥作用，如赵勇[12]的研究发现成熟的miRNA通过RNA干扰作用来抑制SIRT1、BCL2、CDK6与cMET基因的转录，下调蛋白水平上的翻译，接着引起细胞周期捕获、细胞凋亡及细胞侵袭能力下降，最终导致细胞及动物体内水平的细胞生长抑制。

肺部是骨肉瘤转移最常见的部位，一旦发生转移，患者的5年生存率仅为25%～30%，骨肉瘤的转移已成为目前治疗骨肉瘤的一大难题。Steeg[13]研究表明癌症侵袭-转移过程是由多种信号通路及信号通路间的互补代偿机制驱动的，因此在治疗致死性肿瘤转移时通过针对某个特定的靶向分子或信号通路往往无效。目前，多通路或多靶向的联合治疗已被证明是对抗肿瘤转移的有效手段。简超[14]研究证实，生物工程合成的转运RNA/miR-34a嵌合体作为前体药在细胞内以miR-34a的形式可以有效抑制骨肉瘤生长，该实验使用合理设计的阿霉素、转运RNA/miR-34a前体药和索拉非尼三联药物治疗，共靶向关键DNA、信使RNA和蛋白质分子以形成“饱和攻击”原位肿瘤及其转移，明显抑制了骨肉瘤原位生长以及自发的肺转移，延缓了骨肉瘤的进展，即使疾病晚期肺部已出现广泛转移灶仍可延长生存期，最终改善预后。赵勇[12]的研究表明，基因工程获得的miR-34a前体药物不会带来明显的全身毒性作用，其作用机制可能为miR-34a相对特异地诱导了骨肉瘤细胞凋亡与细胞周期捕获。

2 抑癌基因miR-570-3p

自噬在肿瘤中的功能十分复杂，正常生理状态下的自噬可以清除细胞内原发的引起DNA损伤的物质，如活性氧类、受损伤的线粒体和错误折叠的蛋白质等，从而维持基因组DNA的完整性和稳定性，进而抑制肿瘤的发生。虽然基础水平的自噬对细胞是一种保护性作用，但是过度自噬也会引起自噬性细胞死亡甚至加速疾病的进展。自噬性细胞死亡是一种程序性细胞死亡，已成为不同类型肿瘤迁移和侵袭能力的重要标志[15]。在一些转移性肿瘤中，治疗前高水平的自噬通常预示着侵袭性较强，对化疗的敏感性较低，生存期及预后较差[16]。

二甲双胍是一种安全高效的双胍类降糖药，作为胰岛素增敏剂，二甲双胍能够通过减少肝糖原异生，增加周围组织对胰岛素的敏感性，抑制肠道细胞吸收葡萄糖发挥降糖作用，有效降低血液胰岛素水平。流行病学研究表明二甲双胍可以减轻多种肿瘤的进展，二甲双胍可以通过诱导细胞凋亡和自噬抑制肿瘤细胞的生长[17]。二甲双胍的抗肿瘤作用机制尚未明确，但二甲双胍是能量调控信号分子腺苷酸活化蛋白激酶的激动剂，激活腺苷酸活化蛋白激酶负向调控下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路可能是其抗肿瘤作用的机制之一。但腺苷酸活化蛋白激酶在肿瘤中是癌基因还是抑癌基因尚存在争议，其受上游肝激酶B1/丝苏氨酸激酶11的调控，肝激酶B1/丝苏氨酸激酶11的表达缺失或基因突变所致功能缺失都会影响二甲双胍对腺苷酸活化蛋白激酶的激活。

Zhong等[18]和Yan等[19]的研究证实二甲双胍可以引起DNA去甲基化，并导致部分编码基因和非编码RNA的上调。Bao等[20]的研究发现二甲双胍可以削弱骨肉瘤细胞在体内外的迁移和侵袭能力，减轻骨肉瘤的转移和过度自噬，其机制可能是二甲双胍通过对DNA的脱甲基化来增加miR-570-3p的表达，这种上调抑制了靶蛋白的翻译，即肺癌转移相关蛋白质和细胞凋亡相关基因12——肺癌转移相关蛋白质在肿瘤转移中扮演重要角色,而细胞凋亡相关基因12在许多肿瘤中是一个相当重要的自噬标记。这也表明，可以通过上调miR-570-3p，抑制肺癌转移相关蛋白质和细胞凋亡相关基因12的翻译，促进二甲双胍对骨肉瘤细胞转移的抑制作用。

目前，关于二甲双胍对人骨肉瘤细胞转移的影响以及转移与自噬的相互作用的资料还较少，针对这一方向还需进一步研究，以发现肿瘤治疗的新靶点。

3 抑癌基因miR-222

miR-222是属于miR-221/miR-222的miRNA簇，miR-221、miR-222编码位于人X染色体，高度保守，只有相同的种子序列，在多数肿瘤中表达失调。有文献报道miR-222在乳腺癌、甲状腺癌、脑胶质瘤和肝癌等肿瘤中都具有显著的调控作用，说明miR-222在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用：Wong等[21]的研究结果表明在肝细胞癌中，miR-222的过表达能够通过激活蛋白激酶B通路促进细胞转移。Liu等[22]发现在结肠癌细胞中,miR-221/miR-222调节反馈循环保持了核因子κB和信号转导及转录激活因子3的基本活性。Galardi等[23]证实，在人前列腺癌细胞系中，miR-221/miR-222可以通过靶向p27Kip1影响细胞生长潜能。然而，关于miR-222在骨肉瘤中的功能尚不清楚。

Chu等[24]研究了miR-222在骨肉瘤中的作用机制及功能。实验结果显示与正常组相比，骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中miR-222的表达明显降低，另外，过表达的miR-222降低了人骨肉瘤细胞的细胞增殖及侵袭，而敲除miR-222基因可以促进人成骨肉瘤细胞的生长和代谢。该实验进一步发现YWHAG是miR-222的一个潜在靶点，过表达的miR-222可以抑制YWHAG的表达，反之减少miR-222的表达可以提高YWHAG的表达，此外，上调YWHAG的表达可以修复miR-222模拟物的抑制作用。YWHAG是14-3-3蛋白家族的一员，在胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌和血液学肿瘤[25-27]等肿瘤中被报道为肿瘤启动子，它可以促进不同癌症的细胞增殖和转移，其致癌功能可通过多种miRNA调控，如在乳腺癌中，miR-181b-3p可通过直接靶向YWHAG促进上皮-间质转化；在胶质母细胞瘤中，miR-217可以通过调节YWHAG促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力[25,28]。在骨肉瘤中，YWHAG已被报道可以促进骨肉瘤细胞增殖和迁移，并在骨肉瘤调节进程中作为细胞外信号调节激酶1/2抑制和前凋亡蛋白上调之间的链接蛋白发挥作用[29]。这一系列研究结果证明了miR-222可通过下调YWHAG抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力。

上述结果提示miR-222可以抑制骨肉瘤进展，强调了miR-222作为骨肉瘤抑制因子的结果[20]，这可能是骨肉瘤治疗的一个潜在的生物学靶点。

4 其他相关miRNA

尽管国内外研究发现多个miRNA与骨肉瘤相关，但是已证实的有明确靶基因及明确功能的miRNA并不多，除上述介绍的几种miRNA外，还有如下几种miRNA：吴子晏等[30]的研究发现miR-21在骨肉瘤组织中明显过表达，miR-21可以通过降低RECK基因的表达，进而抑制基质金属蛋白酶的活性，促进骨肉瘤细胞的侵袭转移。Liu等[31]的研究发现miR-125b能够通过下调信号转导及转录激活因子3，miR-199a-3p能够通过下调哺乳动物雷帕霉素和信号转导及转录激活因子3的表达，抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移。Hirahata等[32]认为，miR-143可以通过其低表达导致基质金属蛋白酶-13的上调，从而促进骨肉瘤细胞的转移。Zhang等[33]发现miR-195能够作用于FASN基因抑制骨肉瘤的转移。此外miR-92b可通过靶向RECK促进骨肉瘤增殖、侵袭和迁移；miR-199a-5p可双重靶向活化信号转导及转录激活因子3抑制物和p27，促进人骨肉瘤肿瘤生长；miR-135b和含有盘状同源区域结合模序的转录共激活物可以形成促进骨肉瘤上皮-间质转化和肿瘤发生的反馈环；miR-491作为一个肿瘤抑制因子通过抑制αB-crystallin7-10进而抑制骨肉瘤肺转移和骨肉瘤的药物耐药性[34-37]。

5 治 疗

骨肉瘤中差异性表达的miRNA无疑为骨肉瘤的治疗提供了新的治疗靶点。目前基于骨肉瘤中异常表达的miRNA的治疗手段主要包括如下几个方面：①利用反义寡核苷酸抑制癌基因miRNA的表达；②使用miRNA模拟物促进抑癌基因miRNA的表达；③使用锁定核酸技术来提高miRNA与靶基因的亲和力；④表达载体miRNA海绵，可以有效降低细胞中miRNA的含量。然而miRNA在实验室研究中仍存在一些问题，主要集中在以下几个方面：①miRNA制备过程中数量和质量的不稳定性；②辨别miRNA靶点和验证miRNA生物功能的复杂性等。而将miRNA治疗技术从实验室应用到临床工作所需的必要条件仍需探讨，例如如何选择miRNA的传递载体，如何控制miRNA调节药物的特异性及失靶作用，如何减少miRNA介导药物或化合物的体内毒性，以及如何通过量-效关系试验确定miRNA调节药物的最低有效剂量，如何通过制剂的修饰和改进降低有效剂量等。只有解决上述问题，才能使针对miRNA的靶向治疗真正应用到临床，从而延长骨肉瘤患者的生存期及生活质量。

6 小 结

近年来，越来越多的实验研究证明骨肉瘤的发生、发展与miRNA对基因的调控作用密切相关。更重要的是，肿瘤相关miRNA生物标志物可以在生物体液中被检测到，这也使miRNA成为骨肉瘤的潜在生物标志物和药物治疗靶点。肿瘤miRNA分析可以协助确定肿瘤相关亚型、评估患者生存率和对治疗的反应，是癌症诊断和预后评估的重要组成部分。所以，研究miRNA在骨肿瘤，尤其是最常见的骨肉瘤中所起到的作用有一定临床意义。

尽管miRNA与骨肉瘤的研究仍处于起步阶段，许多miRNA的功能和作用途径仍不明确，但越来越多的miRNA干预的成功应用已在基础研究中被证实，少部分miRNA已在尝试进行临床药物试验。快速发展的miRNA作为一类新兴药物作用靶点，将更广泛地应用于骨科肿瘤的治疗领域。同时，miRNA与靶基因之间的作用通路，miRNA之间的相互调控，以及miRNA在骨肉瘤增殖、分化、转移等方面的功能还需要进一步研究。