间充质干细胞调控单核细胞/巨噬细胞介导炎症反应的研究进展

陈柄全,彭 漪,肖 轶,彭智勇,赵吉玲,余国龙

(中南大学湘雅医院心内科，长沙 410008)

间充质干细胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)具有自我更新及多向分化潜能，可促进损伤组织再生修复[1]；除此之外，MSCs具有重要的免疫调控作用[2-3]，其免疫调控机制复杂，尚未完全明确，但MSCs分化和免疫调节的能力已使MSCs移植成为临床上治疗炎症和自身免疫性疾病的热点。有研究证实，MSCs对机体的炎症反应具有重要调控作用，主要机制是通过影响参与炎症反应的免疫细胞增殖、分化和炎性因子分泌[4]。在炎症过程中，单核细胞及分化为组织局灶的巨噬细胞，是参与体内炎症反应的主要功能细胞。研究显示[5]，单核细胞/巨噬细胞参与包括急性心肌梗死等组织炎症反应过程中促炎性损伤、抗炎反应和组织修复的多重作用，MSCs主要通过调节单核细胞/巨噬细胞的表型和功能，促致炎性M1亚型单核细胞/巨噬细胞向抗炎性M2亚型转化，可产生抑制炎性损伤、促进炎性组织修复的效应，从而调控单核细胞/巨噬细胞介导的炎症反应。现就MSCs调控单核细胞/巨噬细胞介导炎症反应效应与机制的研究进展进行综述，以进一步认识MSCs移植产生治疗作用的机制。

1 MSCs生物学特征与免疫调控

MSCs被认为是一种多功能干细胞，能够分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等多种组织细胞。MSCs主要来源于骨髓，还来源于成人组织，如脐带、脂肪、肝脏、肺、肌肉以及肾脏等。1999年Pittenger等[6]发现MSCs多项分化的潜能后才得到学界的广泛关注。MSCs的重要生物学特征是低水平表达人类白细胞抗原 Ⅰ 类分子和诱导效应T细胞所需CD40、CD40配体、CD80或CD86表达，由此，MSCs被认为是免疫豁免的[7-8]。这一特征也是MSCs在人类白细胞抗原不相容个体间移植不发生排斥反应的机制，也决定MSCs移植治疗的安全性和有效性。

已有研究证实，MSCs对先天性免疫及获得性免疫均可产生调控作用[9-11]。国外研究证实，在获得性免疫反应中，MSCs在体内和体外可有效地抑制T细胞增殖，并诱导T细胞分裂停滞[9]，抑制B细胞终末分化[10]。有研究发现在先天性免疫反应中，MSCs可以通过吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)机制抑制自然杀伤细胞[11]。国内外多项实验研究发现，MSCs促致炎性M1亚型单核细胞/巨噬细胞向抗炎性M2亚型转化，可产生抑制炎性损伤、促进炎性组织修复的效应[12-13]。

2 单核细胞/巨噬细胞M1/M2型及转化

单核细胞/巨噬细胞在非特异性免疫和特异性免疫中发挥重要作用，已有研究表明单核细胞/巨噬细胞与大多数急慢性炎性疾病有关[14]，单核细胞/巨噬细胞除参与炎症反应和防御功能外，还具有组织修复、炎症消退、代谢调节等功能[15-16]，而单核细胞/巨噬细胞功能与周围微环境有关。微环境中生物物质(如细胞因子、微生物、微生物代谢产物和其他调节剂，包括核苷酸衍射物、糖皮质激素、感染)可以导致单核细胞/巨噬细胞向不同的方向极化，从而发挥不同功能[15]。Stein等[17]研究发现使用白细胞介素(interleukin,IL)4可上调巨噬细胞甘露糖受体，抑制巨噬细胞炎性细胞因子释放；而γ干扰素(interferon-γ，INF-γ)可抑制巨噬细胞甘露糖受体表达。2013年，两种功能及表型相反单核细胞/巨噬细胞被分别命名为经典活化的单核细胞/巨噬细胞(M1型)和交替活化型单核细胞/巨噬细胞(M2)[15，18]。M1型单核细胞/巨噬细胞可以通过与脂多糖和INF-γ刺激得到，其表面白细胞分化抗原为CD86、CD11c，M1型单核细胞/巨噬细胞主要的生物特性是杀菌活性强，产生多种促炎性介质，包括诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-12和蛋白水解酶[13]，构成对病原体的第一道防线。M2单核细胞/巨噬细胞主要的生物特性是促进炎症吸收与消退，产生多种抑炎介质，促进炎性组织修复[13]。其细胞表面抗原为CD206、CD163，可以通过IL-4刺激诱导产生，其细胞高度表达精氨酸酶1、CC趋化因子配体24、CC趋化因子配体17、IL-4、IL-10等细胞因子[14，19]。在炎症过程中，M1和M2型可在不同条件下会相互转化，如Nahrendorf等[20]首次发现在急性心肌梗死过程中会出现巨噬细胞随着时间的推移发生M1/M2亚型的转化。此后，实验研究进一步证实[21]，在急性心肌梗死炎症浸润开始3 d以M1型巨噬细胞为主，第3天达到最高峰，分泌促炎的细胞因子IL-1、IL-6、IL-8；心肌梗死第3天后，逐渐发生M1型巨噬细胞对M2型的转化，5～7 d M2比例逐渐超过M1，持续直至15 d左右，分泌抑炎的细胞因子IL-10、成纤维细胞生长因子/转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)，协助心肌梗死后的炎症修复过程。

3 MSCs在体外调节巨噬细胞免疫表型

在体外环境下，将MSCs与单核/巨噬细胞直接共培养可以改变单核/巨噬细胞的免疫表型，Kim和Hematti[12]与Abumaree等[13]首先在实验中将人单核细胞加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子条件培养基培养7 d，成功地将单核细胞定向分化为呈“煎蛋样”的M1型巨噬细胞，再与MSCs共培养 3 d，细胞逐渐变为呈“细长纺锤样”且吞噬活性明显增加的M2型巨噬细胞。同时流式鉴定也发现其CD14、CD36、CD163、CD204、CD206等M2型表型增加，相应CD40、CD80和CD86等M1型巨噬细胞表型降低。其培养的细胞上清酶联免疫吸附检测发现促炎性细胞因子IL-1β、IL-12和巨噬细胞炎性蛋白1α分泌减少，而抗炎细胞因子IL-10显著升高。上述学者的研究表明,MSCs可以在体外改变巨噬细胞的形态、炎性因子、免疫表型，使其从分泌促炎的作用为主的细胞因子M1型变成为分泌抑炎促进炎症修复的细胞因子的M2型。研究还发现,这种转化效应是可逆的，如将共培养后的M2型巨噬细胞，再次加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子条件培养基后其M2的表型则显著降低。

4 MSCs在体内调节巨噬细胞免疫表型

4.1MSCs调控心肌梗死巨噬细胞介导炎症反应 MSCs移植对急性心肌梗死中有肯定的疗效，但机制并不明确，巨噬细胞在其中发挥重要作用。Ben-Mordechai等[22]证实大鼠心肌梗死后，通过药物耗竭巨噬细胞，反而增加心肌梗死的面积和死亡率，加速心室重构，心功能不全，而这些负面结果可以被MSCs移植所减弱，与空白对照组相比，MSCs移植治疗可显著提高梗死心肌中F4/80+、CD206+的M2巨噬细胞百分比。Dayan等[23]通过结扎大鼠冠状动脉左前降支制备心肌梗死模型，对大鼠心肌梗死后模型心肌注射MSCs。结果发现与安慰剂对照组相比，MSCs治疗组大鼠心肌纤维化面积显著减少，左心室射血分数显著增高。免疫荧光分析MSCs治疗组心肌中检测到Arg1(M2标记)强表达。上述研究表明，MSCs可以通过调节巨噬细胞介导的炎症反应抑制心肌梗死后的纤维化，改善心功能，促进炎症修复。

4.2MSCs调节肾病巨噬细胞介导的炎症反应 多项研究表明MSCs对多种肾炎有显著治疗作用[24-25]。Li等[26]观察骨髓MSCs治疗糖尿病肾病大鼠疗效，结果显示与空白对照组比较，骨髓MSCs治疗组大鼠存活率高、肾功能改善，且肾脏病理发现肾小球基质沉积和肾小球硬化明显减少。免疫组织化学定量测定发现骨髓MSCs治疗组大鼠肾脏组织促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1蛋白表达水平下降，而抑炎性表皮生长因子表达水平明显增高。有研究表明MSCs可以通过免疫调节和旁分泌作用抑制糖尿病大鼠肾促炎巨噬细胞浸润和炎性细胞因子表达，促进肾脏组织免疫微环境的稳态，从而改善糖尿病肾病病理结构和肾功能[24-25]。

4.3MSCs调节肺部疾病巨噬细胞介导炎症反应 MSCs可以在肺炎中调节巨噬细胞免疫表型抑制其介导的炎症反应，减轻炎症损伤，协助巨噬细胞减少病原菌。Asami等[27]探讨MSCs在急性肺炎链球菌肺炎感染小鼠中的抗炎作用，结果发现与空白对照组相比，MSCs注射后肺炎链球菌感染模型小鼠TNF-α、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和γ干扰素显著降低，且细菌负荷数显著降低；肺泡组织中巨噬细胞表型调节为M2型。其他相关研究同样证实MSCs可以通过在肺部损伤部位极化M2型巨噬细胞抑制炎症进展，促进炎症修复，保护肺部功能[28-29]。

4.4MSCs调节皮肤切口愈合过程中巨噬细胞介导的炎症反应 MSCs可以加速皮肤切口愈合，调节巨噬细胞介导的炎症反应。Zhang等[30]首次将从人类牙龈处分离出来的MSCs为移植细胞，治疗皮肤切口模型小鼠，并设空白对照组。观察两组在相同时间下的切口愈合百分率，并用酶联免疫吸附测定切口皮肤组织TNF-α、IL-6和IL-10水平。结果显示。与对照组比较，MSCs移植治疗组小鼠切口愈合率高，皮肤组织致炎性细胞因子TNF-α和IL-6水平显著降低，抗炎细胞因子IL-10水平显著增加。结果证实牙龈源性MSCs可能通过抑制炎性细胞浸润、炎性细胞因子分泌，促进抗炎细胞因子IL-10产生等机制，促进皮肤切口愈合。其他研究者同样证实了MSCs治疗促进皮肤切口愈合机制主要是通过MSCs旁分泌机制，调控切口组织炎症反应，促进组织的修复[31]。

5 MSCs调节巨噬细胞免疫表型机制

MSCs对单核/巨噬细胞转化机制目前并没有完全被了解，近年来多项研究证实，MSCs影响单核/巨噬细胞主要使通过旁分泌机制，通过分泌IL-10、PGE2、IDO、TGF-β等细胞因子从而使单核/巨噬细胞由M1向M2转化[32-34]。

血浆中抗炎因子IL-10的变化是MSCs移植后的关键，IL-10可以促进组织的炎症修复，降低炎性损伤，促进单核/巨噬细胞向M2转化。Holladay等[35]用MSCs与携带IL-10质粒功能性支架同时置入心肌梗死模型大鼠心肌梗死部位，结果显示与对照组比较，治疗后心肌梗死组织区域M1亚型巨噬细胞显著降低，而M2亚型巨噬细胞显著增加，心肌组织内MSCs存活数量增加，心脏重构逆转和组织炎症程度减轻，并且显著改善心肌梗死大鼠心功能。Jung等[36]直接将IL-10注射到心肌梗死模型小鼠体内，治疗后7 d与安慰剂对照组比较，治疗组心肌梗死后心脏收缩末容积、左心室射血分数、梗死面积显著改善，对心肌梗死周围组织进行免疫组织化学检测发现治疗组分离的组织巨噬细胞CD163、Arg1、TGF-β1等多个M2标记抗体表达显著升高。同时，其他研究也证实MSCs通过旁分泌机制在体内能促进巨噬细胞分泌IL-10，这可能是MSCs介导单核细胞/巨噬细胞M1/M2亚型转化的主要机制之一[32-34]。

PGE2是重要的抗炎因子，Ylöstalo等[37]使用PGE2特异性抑制剂(环加氧酶2抑制剂)后，其巨噬细胞的抗炎作用显著减弱，抗炎的IL-10、IL-1α表达显著下降。在MSCs条件培养基中发现高表达PGE2，采用此培养基促使巨噬细胞M2特异性标记CD206表达升高，增加IL-10的分泌。Hyvarinen等[38]进一步研究MSCs和MSCs外泌体对巨噬细胞的调节作用，发现MSCs和MSC-EV与巨噬细胞共培养，相对于空白对照组可以显著上调IL-10，下调IL-23、IL-22的表达，并上调了巨噬细胞M2的表型和增强吞噬能力。在MSC-EV共培养培养基中发现PGE2显著上调，证明MSC-EV可能是通过PGE2介导巨噬细胞表型改变，并促进炎症介质转换。

MSCs能够释放IDO，而IDO可以促进巨噬细胞向M2转化，并且释放更多的IL-10[39]。Francois等[39]与Lee等[40]在进一步研究中发现，与MSCs共培养后巨噬细胞相比于空白对照IDO的表达上升，炎性因子INF-α下降，M2型巨噬细胞的表达上升，并表现出抗炎的特性；但使用IDO的特异性抑制剂I-MT处理后，INF-α表达上升，其抗炎效应被显著抑制。这些实验表明，MSCs可能是通过IDO途径来调节巨噬细胞免疫表型来调控炎症的。

TGF-β1是M2型单核/巨噬细胞的重要标志性因子，TGF-β1可以反映M2型单核/巨噬细胞的转化率[20，41]，降低炎性损伤，促进组织修复。Liu等[42]在聚糖硫酸钠、诱导的结肠炎模型小鼠中发现，向模型小鼠内注射TGF-β1，其病理切片显示炎症得到显著缓解。注射MSCs后模型小鼠，较空白对照组TGF-β1的表达显著上升，IL-6、IL-17、INF-γ等多种促炎的细胞因子显著下降，巨噬细胞被极化成M2型，并且结肠炎症状得到显著缓解。这说明MSCs可能是通过TGF-β途径调节巨噬细胞免疫表型发挥出抗炎作用。

外泌体是含有生物活性分子，它包括蛋白质小膜质囊泡，信使RNA和微RNA，其可以在细胞之间传送并由此调节细胞活动和表型[43]。Ti等[41]用脂多糖预处理人脐带血MSCs，收集上清液通过超速离心分离得到MSCs外泌体，将外泌体加入巨噬细胞培养基中，处理后的巨噬细胞高表达CD163，且抗炎因子(IL-10、TGF-β)分泌增高，其结果证实MCS-EV可以上调M2巨噬细胞表达。通过微RNA微阵列分析发现是外泌体let7b大量表达，进而通过蛋白质印迹分析发现let7b是通过Toll样受体4/核因子κB/信号转导及转录激活因子3/蛋白激酶B信号通路调节巨噬细胞极化。Song等[44]观察在使用IL-1β处理后的MSCs，选择性将抗炎miR-146a被包入外泌体中转移至巨噬细胞内，使其转化为M2型，发挥抗炎效应。

6 结 语

MSCs在细胞、组织、系统多个水平上发挥其免疫调节作用，对单核细胞/巨噬细胞介导炎症反应是MSCs主要的炎症调控机制之一。MSCs促进巨噬细胞从M1型转化成M2型，释放抑炎的细胞因子，抑制促炎细胞因子的表达，进而减少组织炎性损伤，抑制炎症的进展，促进炎症组织修复。MSCs可能是通过IL-10、IDO、PGE2、TGF-β等途径调节单核细胞/巨噬细胞的免疫表型，但其分子机制还需进一步研究，其结果将有助于了解干细胞治疗机制，并促进干细胞治疗在临床实践中的应用与推广。