牙龈卟啉单胞菌致病岛rag基因在青少年正畸早期的变化研究

孙玉刚 刘助先 韩志强 肖水清 张玉杰

固定矫治过程中由于矫治器的戴入，不利于清洁，形成局部刺激而导致牙龈炎性反应的产生。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是目前公认的慢性牙龈炎的主要致病菌之一，能分泌大量的毒力因子，破坏牙周组织，在牙周病的发病过程中起重要作用[1]。致病岛（pathogenicity islands）的发现使人们对细菌致病性有了进一步的认识。目前，rag位点被确定为牙龈卟啉单胞菌的致病岛基因之一，研究证实，rag位点的失活会使牙龈卟啉单胞菌的致病性降低，对牙周组织的破坏减少[2，3]。rag位点在临床菌株中有4种不同的基因型，分别命名为rag-1、rag-2、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力亦不同[3，4]。我们分别取矫治前，矫治器戴入后1、2、3、6、12个月的龈沟液标本，采用16S rDNA PCR技术及多重PCR技术检测其中的牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因，分析牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因在正畸治疗早期的变化，探讨其与牙龈炎性反应的关系。

资料和方法

1.临床资料：从正畸科随机选取矫治器戴入前牙龈正常的青少年患者45例，其中女30例，男15例。分别取正畸治疗前，正畸治疗中第1、2、3、6、12个月的龈沟液标本。选择标准：所有患者均采用直丝弓固定矫治。3个月内未服用任何抗生素或引起牙龈增生的药物。正畸医师应在正畸矫治开始前1周使用专业口腔检查器械仔细检查患者口腔卫生状况和存在的牙体牙周疾病，如有口腔疾病应告知患者及早治疗。矫治器戴入后，要求患者早晚及三餐后均认真仔细地且采用改良Bass法刷牙，充分做好口腔卫生的防护。实验过程中不能按时复诊的中途剔除。

2.标本采集[5]：无菌纸尖法收集标本，由同一位医师对实验对象进行临床检查和记录，并收集标本。

3.DNA提取：采用加热裂解法提取DNA，并于-20℃保存[5]。

4.引物设计及合成[6]

表1 牙龈卟啉单胞菌及4种rag基因型的引物序列及大小

5.PCR扩增：反应体系：各标本反应体系均为25ul，DNA模板均为5ul，采用TransStart Taq DNA Polymerase PCR试剂盒。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min（33个循环）；最后72℃延伸10min；4℃保存。

6.统计学分析：采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析，P＜0.05有统计学意义。

结 果

一、16S rDNA PCR及多重PCR对临床标本的检测结果

16S rDNA PCR：标准菌株1和临床标本3，4，5，7，8均扩增出目的条带（404bp），而临床标本2，6，9未扩增出目的条带，见图1。

多重PCR检测结果：临床标本a、b、d均扩增出rag-1型（628bp），c扩增出rag-2型（979bp），e扩增出rag-3型（423bp），d扩增出rag-4型（739bp）见图2。

图1 16S rDNA PCR对临床标本中Pg的检测结果

图2 多重PCR对致病岛rag基因的检测结果

表2 普通PCR及多重PCR对临床标本的检测结果

经统计，从正畸治疗前、正畸治疗后第1、2、3、6、12个月牙龈卟啉单胞菌的检出率可看出，Pg在正畸治疗后前2个月逐渐上升，2个月后开始下降，到第6个月和12个月基本趋于稳定，但仍高于矫治器戴入前（表2、图3）。由rag基因的检出率可看出，rag基因的检出率在正畸治疗第一个月开始上升，到第2、3个月时最高，3个月后逐渐下降，到第6个月和12个月时趋于稳定，但仍高于矫正前（表2、图3）。

二、P.gingivalis及致病岛rag基因检出率与临床指标之间的关系（表3）

牙龈卟啉单胞菌和致病岛rag基因的检出率与GI和时间t之间均存在明显的正相关关系（Spearman等级相关分析，rs＝1.000，P＜0.01）。

图3 Pg与rag基因检出率

三、4种Rag基因型牙龈卟啉单胞菌临床菌株的分布情况

4种不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌菌株的分布情况见表4。从总检出例数来看，rag-3型的检出率最高，rag-4型次之，rag-1和rag-2型相对较低，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 牙龈卟啉单胞菌及rag基因检出率与GI之间的关系

表4 4种Rag基因型Pg临床菌株的分布情况

讨 论

随着社会的进步，生活水平的提高，人们对口腔保健越来越重视。近几年来，接受正畸治疗的人越来越多。但固定矫治器由于不利于清除食物残留，易导致牙龈炎症的产生[7]。有研究发现正畸患者在矫治过程中如若能保持良好的口腔卫生，那么就可以降低牙龈炎的发生率[8]。目前，越来越多的正畸医师开始关注正畸治疗中口腔的卫生和牙周组织的健康问题。近年研究结果表明，龈下菌斑是引起牙龈炎症的始动因子，大多牙龈病都是由微生物感染所致[6]。牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）是目前公认的重要牙周致病菌[1]。

本实验对临床标本中的牙龈卟啉单胞菌进行检测，Pg检出率在正畸治疗前2个月逐渐升高，2个月后又逐渐下降，到第6个月和12个月基本趋于稳定，但仍高于矫治前，说明矫治器的戴入对正畸初期口腔微生物动态平衡的影响较大。曾有人对不同时期固定正畸治疗患者口腔细菌进行厌氧培养，并与GI进行相关性分析，结果表明：矫治器对口腔微生态平衡影响的关键时期是戴用后前3个月[9]。

病原菌致病是多种因素、多种原因共同作用的结果，致病岛的发现使人们对细菌致病机制及致病性有了更深入的认识。致病岛又称毒力岛，是一个分子质量相对较大的基因片段，用于编码细菌毒力基因簇，是整合于细菌基因DNA组的外源性成分，其可能来自于细菌进化过程中DNA的基因水平转移事件。目前，rag位点被确定是牙龈卟啉单胞菌的致病岛基因之一[3，4]。该位点主要含有ragA和ragB基因，分别编码RagA和RagB蛋白。Rag蛋白构成膜转运系统，协助细菌从外部环境获取转运大分子，利于细菌的存活和播散；同时Rag蛋白还能够激活宿主的免疫及炎症反应[10]研究证实，rag位点的失活会使牙龈卟啉单胞菌致病性降低，对牙周组织的破坏减少[11]。

本实验结果中，rag基因的检出率在正畸治疗第一个月开始上升，到第2、3个月时最高，3个月后逐渐下降，到第6个月和12个月时趋于稳定，但仍高于矫正前。GI在正畸治疗后逐渐升高，第2个月达到高峰，然后逐渐下降，与rag基因的检出率呈正比。研究结果表明致病岛rag基因在正畸早期牙龈炎的发生发展中起到非常重要的作用。

rag位点在临床菌株中有4种不同的基因型，分别命名为rag-1、rag-2、rag-3和rag-4[11，12]。Amano等[13]研究报道，两种或几种不同基因型的牙龈卟啉单胞菌菌株可以存在于同一个患者龈下菌斑中。本研究中也发现同一个样本中可同时检测出几种基因型的牙龈卟啉单胞菌。本研究结果中：rag-3型牙龈卟啉单胞菌检出率最高，rag-4型次之，rag-1型和rag-2型的检出率相对较低。Hall等[12]研究发现不同国家和地区的牙龈卟啉单胞菌的rag基因型的分布不同，有一定的地域或种族的差异。本研究结果认为rag-3型牙龈卟啉单胞菌与该地区青少年正畸牙龈炎发生发展的关系更为密切。