口腔鳞状细胞癌组织PRSS8基因启动子甲基化状态及其临床意义

张素欣 李天客 郭 杰 包 阳 宋 艳 常晴晴 陈 中

OSCC的治疗手段目前仍是以手术治疗为主，化、放疗、生物治疗相结合的综合治疗，虽然近些年来治疗手段越来越丰富，设备也越来越先进，国际上光动刀疗法及靶向治疗有了长足的进步，但是由于OSCC浸润性强、颈部淋巴结转移早、复发率高，因此患者术后生存质量较差、预后不理想。所以提前发现病灶，并把癌变过程控制在早期阶段显得尤为重要。

人类的前列腺蛋白（Prostasin）基因又被简称为PRSS8或CAP-1，是一种于1994年首次在人体精液中发现的丝氨酸蛋白酶（40KDa）。PRSS8在上皮屏障功能上显示了其重要性，而且参与多种炎症、表皮生长、肿瘤的发生发展过程[1]。研究表明PRSS8在胃癌[2]，乳腺癌[3]，食管癌[4]，膀胱癌[5]，前列腺癌[6，7]组织细胞中起到抑癌基因的作用，并且在上述癌症中均因高度甲基化导致了PRSS8表达的减少。PRSS8可以通过调节多种通路抑制多种肿瘤的发生，参与肿瘤的发生与发展。但目前尚未发现PRSS8在OSCC中的相关报道。本实验拟通过利用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific PCR，MSP）及逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）法分析52例OSCC组织及相应癌旁2cm处的正常口腔黏膜组织中PRSS8基因的表达情况及甲基化状态，并结合临床数据进行相关分析，进一步揭示OSCC的发病机制，为OSCC的早期发现、预后的判断提供理论依据。

资料和方法

1.实验研究对象：本实验研究所采用标本均来自于2014年8月至2016年8月在河北医科大学第四医院口腔科住院并行手术治疗的OSCC患者。所取标本包括每例患者的OSCC原发灶组织和在距离原发灶2cm处切取的正常口腔黏膜组织，52例OSCC中男性患者30例，女性患者22例，男女比例为1.36：1。年龄最大者79岁，年龄最小者25岁，平均年龄58.3岁，吸烟史（≥3支/天，时间≥1年），吸烟29例，不吸烟23例。饮酒史（≥50ml/天，时间≥1年），饮酒27例，不饮酒25例。按照2010年AJCC对唇和口腔鳞癌TNM分期标准，对术后病人进行TNM分期，其中Ⅰ+Ⅱ期21例，Ⅲ+Ⅳ期31例。依据有无淋巴结转移分组，有淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者29例。按照1997年WHO推荐将FuhrmanⅠ、Ⅱ级合并为高分化，FuhrmanⅢ级为中分化，FuhrmanⅣ级为低分化，高中分化组为34例，低分化组18例。所有标本均经术后病理证实，标本离体后均迅速保存于液氮中，之后转移至生物标本库-80℃冰箱统一保存管理。本研究已通过河北医科大学第四医院伦理委员会批准。

2.主要试剂和仪器（表1）。

PRSS8基因RT-PCR引物序列：上游：5'-ACTGCTCGCTTCGGATACTC-3'；下游：5'-CAGGCACGCAAGGTAGGAA-3'；扩增产物长度为174bp，退火温度56℃。

PRSS8基因甲基化引物序列：上游：5'-TTATAGGTATTCGTTATTACGTTCG-3'；下游：5'-ACACTTTAAAAAACCGAAACCGACG-3'；扩增产物长度为126bp，退火温度55℃。

表1 主要试剂和仪器

3.MSP检测OSCC组织和癌旁组织中PRSS8甲基化状态：应用DNA提取试剂盒提取OSCC组织中的DNA并进行纯化。设计相应的MSP引物及非甲基化特异性引物。扩增条件∶95℃，预变性10分钟，一个循环；94℃，变性，45秒，退火温度按上述温度，45秒，72℃，延伸45秒，共35个循环；72℃再延伸10分钟。采用Gel Doc XR图像分析系统进行分析。甲基化发生率的统计分析∶甲基化率（%）＝（完全甲基化标本数+不完全甲基化标本数）/总标本数×100%。MSP阳性对照采用经甲基化酶SssⅠ处理以后的基因组DNA进行PCR，阴性对照采用灭菌双蒸水代替DNA模板进行PCR扩增。为对MSP检测的进行质量控制，随机选取10%的标本进行重复实验，重复性达到95%以上。

4.RT-PCR法检测OSCC组织中PRSS8基因mRNA表达水平：首先按TRIzol试剂说明书提供的操作步骤提取OSCC和癌旁组织中的总RNA，采用紫外分光光度计测量其含量及纯度，并参照反转录试剂盒说明书步骤，将RNA反转录为cDNA，之后以该cDNA为模板，加入反应体系进行PCR扩增，以GADPH作为内参照。扩增条件：95℃，预变性10分钟，一个循环；94℃，变性，45秒；退火温度按上述温度，45秒；72℃，延伸45秒，共35个循环；72℃再延伸7min。

5.统计学处理：采用SPSS statistics 21.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验统计方法，计量资料两样本间均数比较采用t检验或t'检验，多样本间均数比较采用单因素方差分析统计方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.OSCC和癌旁组织中PRSS8基因的甲基化状态：MSP检测结果OSCC组织PRSS8及PTPN22基因启动子甲基化率均明显高于相应正常组织（57.7%vs34.6%χ2＝5.571，P＝0.018）

2.OSCC和癌旁组织中PRSS8基因mRNA的表达情况：PRSS8基因mRNA的相对表达量在OSCC组织中明显低于相应癌旁组织（0.44±0.12vs0.71±0.13 t＝-10.620，P＝0.000）

3.PRSS8基因启动子甲基化与患者临床参数之间的关系：PRSS8基因甲基化状态与分化程度、淋巴结转移、病理分级相关（均P＜0.05）。

4.OSCC中PRSS8基因mRNA相对表达水平及与临床参数之间的关系：OSCC组织中PRSS8基因mRNA的表达与分化程度、淋巴结转移、病理分级相关（均P＜0.05）。

图1 PRSS8基因在口腔鳞癌及正常组织中的甲基化状态

图2 PRSS8基因和内参mRNA在口腔鳞癌及正常组织中的表达

表2 口腔鳞癌组织和正常组织中PRSS8基因甲基化情况

表3 口腔鳞癌组织和正常组织中PRSS8 mRNA相对表达量

表4 口腔鳞癌组织中甲基化组和非甲基化组PRSS8mRNA相对表达量的比较

表5 PRSS8基因甲基化状态与临床病理特征的关系

表6 PRSS8mRNA相对表达量与临床病理特征的关系

讨 论

PRSS8基因位于染色体16p11.2[2]，其编码的蛋白又称为人类的前列腺蛋白（Prostasin）或CAP-1，自1994年首次在人体精液中发现以来，关于PRSS8的研究日益受到重视。它是一种丝氨酸蛋白酶，长度约40KDa，其编码的蛋白广泛分布于人类各正常组织中，尤其是上皮组织，能够参与生长因子的调节、细胞的迁移等生理及病理过程[1，2]。近些年来研究表明，PRSS8基因在胃癌[3]，乳腺癌[4]，食管癌[5]，膀胱癌[6]，前列腺癌[7，8]等诸多癌症中表达下调，在上述癌组织等中均可以观察到PRSS8的甲基化状态。BAO[5]等人利用转染技术确定PRSS8启动子的区中的CPG岛具有生物学功能，并且这个区域的甲基化可能导致PRSS8表达的抑制，所以推断食管癌癌组织中PRSS8的减少可能与PRSS8的启动子甲基化有关，通过对食管癌细胞使用5-氮杂胞苷（地西他滨，DAC）进行干预，结果显示抑制了食管癌细胞的增殖和迁移，修复后的细胞周期停滞在G1期。由此推断PRSS8可以作为一个抑癌基因在人体内发挥作用的。

本研究的实验结果表明，在52例OSCC组织及相应正常黏膜组织中，OSCC组织中的PRSS8基因启动子区甲基化的发生率显著高于相应正常组织甲基化发生率，提示PRSS8基因通过启动子区甲基化可能是OSCC的发生机制之一。本研究的这一结果与PRSS8基因在食管鳞癌[3]等多种癌症中的研究基本一致。此外，本此研究还检测了52例OSCC患者中癌组织及正常组织中PRSS基因mRNA的相对表达量，结果表明，OSCC组织中PRSS8基因的相对表达量明显低于相应正常组织。这一结果提示，PRSS8基因在OSCC中可能主要起抑癌基因的作用，与PRSS8在其他癌症的研究一致。为探讨OCSS中PRSS8基因表达下降是否与其启动子区发生甲基化密切相关，进一步比较了发生甲基化的OSCC组织与未发生甲基化的OSCC组织中PRSS8基因mRNA的相对表达量，结果表明，甲基化组PRSS8基因mRNA相对表达量低于非甲基化组，初步证实了在OSCC中，PRSS8基因启动子区发生甲基化可能是引起其mRNA相对表达降低的原因之一。本实验同时研究了PRSS8基因甲基化率与OSCC患者临床资料间的关系，发现52例OSCC标本中PRSS8基因甲基化率与患者的性别、年龄、饮酒、吸烟等之间均未见明显统计学差异，这与以往的研究结果有差别，以往的流行病学研究显示，烟草、乙醇和槟榔等是口腔癌发病的化学因素，而此次的研究无统计学意义，分析原因，可能是因为样本量较少，数据进行统计学分析时校验效能下降。也正因如此，本实验中PRSS8mRNA相对表达量与临床资料进行统计学分析也未见明显统计学差异，有待于日后扩大样本量进一步明确PRSS8基因甲基化及其mRNA相对表达量降低与OSCC患者饮酒、吸烟等临床资料的关系。本研究发现PRSS8基因甲基化及其mRNA相对表达量降低与临床分期，淋巴结转移，病理分期等临床资料呈正相关，有统计学意义，说明PRSS8基因启动子区甲基化可能与OSCC的预后有关。

因PRSS8参与了上皮组织的形成与粘附过程，细胞粘附分子（E-cadherin）是一种跨膜糖蛋白，分子量为124KD，主要分布于非神经上皮组织，在维护上皮细胞形态、结构完整性和极性中起到重要作用。

Diniz-Freitas M[9]等发现通过转染E-cadherin蛋白能够抑制肿瘤细胞的侵袭，推测E-cadherin表达的减少是可以作为一种恶性标志。在分子水平，表皮生长因子受体（EGFR），E-cadherin和E-cadherin的转录抑制物（如SNAIL和SLUG）已被证明在恶性膀胱癌的进展过程中扮演了重要的作用[10]。而在慢性结肠炎相关结直肠癌的相关研究中发现PRSS8通过激活Sphk1/S1p/Stat3信号传导信号传导途径对Stat3的持续激活更加促进β-catenin的细胞核内转移和聚集，E-cadherin的表达下降，影响细胞的紧密连接[11]。越来越多的证据表明E-cadherin通过调控GSK3β，Snail/Slug和Akt/PKB[12～14]等信号通路的表达在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。E-cadherin的正常表达可以使可以阻止肿瘤的浸润和转移[15]。

E-cadherin的表达下调与OSCC的组织分化、侵袭和转移能力、预后密切相关[16～18]。在今后的研究中，可应用western-blot、基因敲除等技术进一步验证此基因与E-cadherin与OSCC的关系。总之，本研究提示PRSS8启动子区CpG岛的异常高甲基化可能是导致OSCC中相应基因表达降低的重要机制之一，PRSS8有可能是OSCC早期诊断的生物标记物。