增塑剂DEHP暴露对青春期小鼠社会行为的影响

李季穗， 仇军辉， 陈寒青， 王倩倩， 姚凯旺，张其臻， 胡一中， 徐晓虹

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

邻苯二甲酸二乙基己酯(di-ethylhexyl phthalate,DEHP)有良好的成塑性能,因此被大量应用于塑料产品的生产，如医疗领域的血袋与输液管、食品包装及儿童玩具等.人们可经口、呼吸道和皮肤摄入环境中的DEHP.DEHP具有类雌激素、阻碍雄激素活性的性质，可影响人体性激素的分泌，是一种公认的环境内分泌干扰物质.因其特性，DEHP对人类生殖发育的不利影响已经受到了越来越多研究人员的关注[1].最近的实验表明， 若DEHP暴露于小鼠出生前，就会阻碍其大脑神经的发育，使鼠的胚胎神经管发育畸形[2]，下丘脑芳香化酶表达减少[3]，影响下一代的记忆[4-5].青春期是脑发育和社会认知形成的第2个关键时期，此时发育中的性腺分泌的性激素对性别二态行为的形成起关键作用，所以人体极易受到DEHP等物质的干扰[6].由实验数据可发现，青春前期给鼠注入DEHP，会降低鼠脑的记忆功能，同时会使鼠产生烦躁感与焦躁感[7].

早期的社会玩耍和交互行为有利于社会技能和社会认知的发展，对动物的生存和繁衍非常重要，而青春期产生的性激素影响社会行为的性别分化.DEHP有抗雄激素效应[8]，可以影响体内雄激素活动.笔者推测，小鼠若暴露于DEHP，会影响其生长发育，并且导致成年小鼠的行为发生异常.黑质纹状体多巴胺(dopamine,DA)神经递质系统参与情绪和社会行为的调控，神经元树突形态与行为密切相关.因此，在假设青春期DEHP暴露影响成年雄鼠社会行为的基础上，探讨其作用是否与神经元树突形态和纹状体DA递质系统活动的改变有关.

1 材料和方法

1.1 实验动物、模型制备与分组

在浙江省医科院动物中心采购ICR 3周龄小鼠，正常条件下适应1周，根据以往实验数据，建立3组DEHP染毒实验.1,10和50 mg·kg-1·d-1(药理剂量根据体表面积换算相当于人0.081,0.810和4.050 mg·kg-1·d-1)[9]和溶媒对照组(花生油).连续3周对小鼠灌胃染毒DEHP，达到8周龄后进行各项检测.另每组8只鼠眼眶取血，利用放射免疫法测试小鼠脑内、血清的睾酮水平，同时提取脑纹状体组织用于蛋白表达检测，然后称重分离睾丸，计算睾丸与体重比，即睾丸系数.

1.2 行为测试

行为测试按以下顺序进行.全部的实验通过小动物分析系统采集.为防止小鼠的气味影响下一个小鼠的行为，需要用75%的乙醇对模型进行消毒去味.

旷场行为观测箱(40 cm×40 cm×30 cm)平均分成16格，中央区是中间4格.用于记录小鼠在5 min内的跑动穿越格数、站立次数、理毛次数及在中央停留的时间，并且探究小鼠在陌生环境里是否会自主进行其他活动(n=15).

高架十字迷宫的组成部分有:2个相对封闭臂(30 cm×5 cm×15 cm)、2个相对开放臂(30 cm×5 cm)、连接四臂的中央平台(5 cm×5 cm)，距离地面50 cm.动物因恐惧于悬空的开放臂产生焦虑情绪，同时又无法抑制对开放臂的好奇而产生冲突的心理活动，在测试过程中以5 min内开放臂下动物所停留时间作为其焦虑情绪，中央区域所得探头次数体现动物自身的探究意愿，封闭臂及开放臂中动物总的进入次数代表动物自身活动性(n=15).

在检测动物的社会玩耍行为时，将小鼠组织在一个形状为长方形的笼盒(45 cm×35 cm×20 cm)内.记录15 min内2只相同年龄、性别和处理的陌生小鼠互相爬跨、追逐、打斗、理毛和嗅探等作为玩耍指标，其中互相理毛和嗅探视为社会探索的指标(n=10对)[10].

三室模型由3个隔间的矩形形状的笼盒(56 cm×29 cm×23 cm)组成，为了方便筒内外的小鼠进行交流沟通，在左右的隔间内各放置了一个不锈钢材质的圆筒，中隔间两侧分别有门洞允许小鼠自由出入左右隔间.通过记录5 min内待测小鼠在含陌生鼠圆筒的隔间(社会区域)和含空圆筒的隔间(非社会区域)停留时间和对陌生鼠或对空圆筒的嗅探的时间差距(n=20)，来观察小鼠之间的社会交互能力.如果小鼠在嗅探陌生鼠的时间或在社会区停留的时间越长，那么其社会交互能力也越强[11].

强迫游泳模型是通过判断动物对周围恶劣环境的敏感性和排斥反应来评价小鼠的抑郁状态[12].圆柱形游泳池直径为30 cm、水深为25 cm.测试时将1只小鼠放入泳池中央，记录在强迫游泳状态下，小鼠在6 min内保持静止的总时间，时间越长表示抑郁越严重(n=15).

1.3 Western blot检测DAT,AR及D2蛋白

每组取小鼠(8周龄)断颈处死后取脑，4 ℃下分离双侧纹状体组织，制备蛋白样品分装，-20 ℃保存备用.取10～20 μL的蛋白样品开展十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，将蛋白湿转到硝酸纤维素膜(NC)，封闭4 h，分别加相应一抗(β-actin(1∶800)，AR(1∶600)，DAT(1∶300)，D2(1∶400))(美国Santa Cruze公司)孵育、漂洗.然后对NC膜和辣根过氧化物酶标记后的羊抗兔二抗(1∶2 000)进行孵育，漂洗，并用免疫化学发光试剂使其着色，经过X光片曝光后进行扫描，最后用Quantity One软件半定量分析蛋白条的带光密度.

1.4 新生大鼠海马神经元离体培养

取出生24 h内的SD大鼠脑，在4 ℃下分离海马，在35 mm培养皿中的小玻片上制备常规的神经细胞悬液并在培养皿中多聚赖氨酸包被，细胞密度1×105cells/cm3，培养于37 ℃含5% CO2培养箱中.4～5 h后，换成Neurobasal+2% B27培养液(美国GIBCO公司)，在接下来的实验中每隔3.5 d更换培养液，到了第5 d，使其DEHP的最终浓度分别保持为1,10,100,1 000 nmol/L.在对照组中加入溶媒DMSO(终浓度<0.001%)，继续培养并观察5 d.4%多聚甲醛固定细胞，鬼笔环肽湿盒室温孵育染色，清洗后封片.激光共聚焦显微镜下观察拍照，Meta Morph图像分析软件测量树突棘和树突丝密度.每组测量3个独立皿的35个神经元(n=35).

1.5 统计学处理

所有数据采用平均值±标准误差(M±SE)表示，使用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析DEHP暴露效果，并进行Post-hoc test的Tukey检验，P<0.05表示差异具有统计学意义.

2 分析结果

2.1 探讨DEHP对血清、脑内睾酮水平及睾丸体重的影响

暴露在1 mg·kg-1·d-1剂量下，DEHP明显降低了小鼠脑内睾酮水平；DEHP剂量为50 mg·kg-1·d-1时，降低了血清睾酮水平(P<0.05)，但没有改变其睾丸和体重系数.实验表明，青春期1,10和50 mg·kg-1·d-1的DEHP暴露不会对雄鼠的生殖器官发育造成显著的影响(见图1).

与对照组相比，具有显著性差异*( P<0.05)

2.2 探讨DEHP对小鼠旷场行为的影响

50 mg·kg-1·d-1DEHP会明显降低小鼠的跑动格数(P<0.05)，1,10 和50 mg·kg-1·d-1DEHP会使小鼠站立次数明显减少(P<0.05)，表明成年雄鼠的活动性缩减和探究意愿减少与青春期DEHP暴露有关(见图2).

与对照组相比，具有显著性差异*( P<0.05)；具有极显著性差异** (P<0.01)

2.3 探讨DEHP对小鼠高架十字迷宫和强迫游泳行为表现的影响

1 mg·kg-1·d-1DEHP明显减少了小鼠在开放臂的驻留时长(P<0.05)，但对所有臂的总进入次数、中央区的探头次数和开放臂的进入次数并无明显影响(见图3a～3c)；此外，1,10和50 mg·kg-1·d-1DEHP明显增加了小鼠强迫游泳时停止不动时间(P<0.05，P<0.01)(见图3d)，这表明，青春期DEHP暴露会影响小鼠的抑郁、焦虑情绪.

与对照组相比，具有显著性差异*( P<0.05)；具有极显著性差异** (P<0.01)

2.4 探讨DEHP对小鼠社会交互行为和社会玩耍行为影响

在社会玩耍测试中，DEHP暴露不影响雄鼠的玩耍及与陌生鼠的相互接触次数(见图4a～4b)；三室模型的检测结果显示，DEHP会明显减少鼠在社会区域的驻留时间(P<0.05，P<0.01)，而对其他陌生鼠接触的时间影响较小(图4c～4d).结果表明，青春期DEHP暴露会抑制小鼠社会交互能力和探究意愿.

与对照组相比，具有显著性差异*( P<0.05)；具有极显著性差异** (P<0.01)

2.5 探讨DEHP对小鼠纹状体内D2，DAT和AR表达情况的影响

成年雄鼠社会行为和情绪与DA递质系统密切相关.实验结果表明，DEHP暴露不影响纹状体DAT表达，但明显降低了D2和纹状体AR水平(P<0.01)(见图5).

与对照组相比，具有显著性差异*( P<0.05)；具有极显著性差异** (P<0.01)

2.6 探讨DEHP对离体培养的海马神经元细胞树突棘密度和树突丝的影响

对离体培养的海马神经元，DEHP暴露5 d后显著减少了海马神经元树突丝和树突棘的密度.结果表明，DEHP抑制离体培养的新生海马神经细胞树突的发育(见图6).

与对照组相比，具有显著性差异*( P<0.05)；具有极显著性差异** (P<0.01)

3 讨 论

3.1 青春期小鼠暴露于DEHP加剧焦虑抑郁情绪并抑制社会行为

同一物种的不同个体相互作用而发生社会行为，以维持生存与繁衍后代的需要.社会玩耍从社会探究开始，表现为2只陌生小鼠通过相互嗅探来熟悉对方，小鼠将进行社会玩耍作为融入社会的开端[10].实验表明，青春期DEHP暴露对小鼠社会玩耍行为没有影响，但是在一定程度上减少了相互嗅探和相互接触等社会探索行为，同时青春期DEHP暴露抑制了小鼠的社会交流意愿及社会探索能力.根据小鼠在三室模型社会区域停留时间的降低，以及与陌生小鼠接触时间的轻微减少，可以得出青春期DEHP暴露降低了小鼠的社会交互能力和社会新奇偏好能力.发育期间性激素可调节啮齿类动物的社会行为，比如雄激素可调节动物的玩耍打斗，新生儿时期给予睾酮的雌性大鼠社会玩耍行为雄性化[13].社会行为受多因素的影响，但有关环境内分泌物对社会行为的研究知之甚少.有人发现，多氯联苯可减少雄鼠的社会交互行为[14].DEHP作为一种环境内分泌干扰物，不仅有类雌激素的性质，同时能抑制雄激素活性,发挥抗雄激素作用[15].实验结果表明，青春期DEHP暴露会对小鼠的社会探究和社会交互行为造成抑制效果.据此推测，DEHP抑制了小鼠体内雄激素的活性，从而抑制了小鼠的社会行为.低焦虑和抑郁状态的动物往往表现出较高的社会玩耍和社会交互能力，延长与陌生同伙相互接触的时间[16].鉴于小鼠在开放臂的停留时间减少和强迫游泳的静止时间延长的实验结果，可以得出DEHP导致了小鼠焦虑抑郁情绪的加剧，表明DEHP对小鼠社会行为的抑制效果和焦虑、抑郁情绪的恶化有一定的关联.

3.2 青春期小鼠暴露于DEHP阻碍脑内神经元树突的发育并降低纹状体AR和D2的表达水平

雄激素调控小鼠的焦虑抑郁情绪和社会行为的作用受到雄激素受体AR的影响[17].有研究表明，在围生期雄性小鼠海马脑区内，由于DEHP暴露，导致其AR表达能力明显下降，同时还会产生焦虑及抑郁等现象[18].本研究发现，青春期DEHP暴露不仅影响雄鼠脑和血清睾酮激素水平，还显著下调了纹状体AR表达，提示DEHP可能通过下调睾酮水平和AR水平而抑制雄激素对小鼠焦虑和社会行为的调节作用.AR影响社会行为调节，同时纹状体DA递质也会影响动物情绪和行为.社会玩耍伴随着前脑DA的传递而增加，DA传递的阻断剂可减少社会玩耍[19]，而DA受体激动剂增加社会玩耍[20]；大鼠成年后会伴有抑郁情绪，这种现象的产生与纹状体DA受体D2表达水平降低有关[21]；表明纹状体等脑区的DA系统参与焦虑抑郁情绪和社会玩耍行为.本实验表明，虽然成年雄鼠其纹状体DA转运体(DAT)表达不受到青春期DEHP暴露的影响，但是DA受体D2水平却因DEHP暴露而明显下降.此外，我们还发现，DEHP抑制神经元树突棘密度.树突是信息传递的关键结构，与行为密切相关；而D2介导动物的情绪、行为和运动.因此，DEHP暴露引起的D2水平下降导致的DA递质系统异常和树突发育抑制可能与雄鼠成年后的促焦虑抑郁和社会行为减少有关.

综上所述，虽然青春期暴露于1，10和50 mg·kg-1·d-1DEHP对生殖器官发育没有影响，但是在一定程度上却减少了小鼠脑内和血清雄激素水平，减少了社会探究和社会交互能力，并加剧焦虑抑郁状态；而纹状体脑区DA受体D2和AR水平的下调及神经元树突发育的抑制可能与其情绪和社会行为的改变有关.若想探明DEHP对小鼠焦虑抑郁情绪和社会行为影响的神经机制，还需进一步设计实验.同时，笔者使用的DEHP剂量远远低于其无不良效应极限值，但仍然加剧了小鼠的焦虑抑郁情绪，并抑制了小鼠的社会行为.因此，应对DEHP低剂量暴露对机体的危害引起足够的重视.