戒毒一号对甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化的影响

李 灿，唐利军，司远仁，肖华桥，茹 琴，周 梅，李超英*

（1.江汉大学 武汉生物医学研究院，湖北 武汉 430056；2.应用毒理湖北省重点实验室，湖北 武汉 430075；3.武汉万济精神病医院，湖北 武汉 430050）

0 引言

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）为苯丙胺类精神兴奋剂，应用后会提高中枢神经系统内多巴胺（dopamine，DA）水平，产生强烈的欣快效应，是一种合成毒品。与传统毒品主要的镇静、镇痛作用不同的是，METH具有精神依赖性和神经毒性两个主要特点，摄入后短时间即可诱发神经损伤[1]。METH的长期滥用可促发成瘾者精神疾病和攻击行为，造成显著的神经退行性改变[2]。METH成瘾者普遍表现为严重的依赖性和很高的复吸率，目前尚无有效治疗药物。因此，寻求有效、低毒的干预药物对METH成瘾患者的临床治疗意义重大。

毒品致病机制复杂，近年来中药戒毒成为国内外研究的热点。本课题组为了从中药中寻找有效的戒毒复方，进行了大量戒毒中药筛选，制备了由延胡索、党参、甘草、茯苓、白术、西洋参、黄芪、当归8味中药组成的戒毒一号（Jieduyihao，JDYH）。行为敏化（behavioral sensitization）系指反复、间断给予依赖性药物（如吗啡、苯丙胺、可卡因、尼古丁、酒精等）后，动物对依赖性药物的行为效应增加，又称反向耐受[3]。行为敏化是动物成瘾的主要特征之一，建立行为敏化动物模型为研究药物成瘾的神经生物学机制以及评价相关药物对行为敏化的干预作用提供了重要的试验手段，目前已得到广泛的研究和应用[4-5]。本研究拟通过考察中药复方戒毒一号对METH诱导的行为敏化的影响，评价戒毒一号在防治METH成瘾中的作用，为戒毒一号下一步进行临床研究提供依据。

1 仪器与材料

C57BL/6小鼠，SPF级，雄性，体重18～ 22 g，动物合格证：SCXK（京）2016-0011，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，湖北省实验动物设施使用证明由江汉大学实验动物中心提供（No.00020518）。将小鼠随机分组，每组15只。温度（22±1）℃，湿度（50±10）%。所有关于动物实验的操作均符合江汉大学医学伦理委员会要求。

戒毒一号总重94 g（各组分中药购买自湖北天济中药饮片公司）。用1 400 mL水煎煮中药至400 mL，浓缩成所需浓度的浸膏，灌胃给药。METH（纯度98%）由湖北省公安厅禁毒总队提供，溶于生理盐水，腹腔给药。戒毒一号和METH均现配现用。

小鼠产生行为敏化效应的行为特征表现为自发活动显著升高，主要由其活动距离来反应。小鼠的运动行为由动物自发活动视频分析系统记录，此系统由8个等大（25 cm×25 cm×45 cm，长×宽×高）的隔音箱组成，宁波安来科技公司制造。本试验METH诱导小鼠的行为敏化的试验方法参考Li JING等[6]的研究。

2 方法

2.1 戒毒一号单次给药对小鼠自发活动的影响

取C57BL/6小鼠45只，随机分成3组，即对照组（同体积生理盐水）、戒毒一号低剂量组（14.12 g/kg）和戒毒一号高剂量组（56.48 g/kg）。单次灌胃给药60 min后进行小鼠的自发活动检测来判断单次灌胃戒毒一号对小鼠自发活动的影响。测定60 min，每隔5 min记录数据1次。

2.2 戒毒一号多次给药对小鼠自发活动的影响

取C57BL/6小鼠45只，随机分成3组，即对照组（同体积生理盐水），戒毒一号低剂量组（14.12 g/kg）和戒毒一号高剂量组（56.48 g/kg）。形成期各组灌胃相应药物，连续7 d，转化期停药7 d（无任何处理）。第15天，给药组小鼠给予相应剂量的戒毒一号并检测自发活动，观察戒毒一号自身是否产生行为敏化。分别在第1天，第7天，第15天给药60 min后测定60 min内小鼠的自发活动性。详细流程见图1。

2.3 戒毒一号对急性METH处理后所导致小鼠高活动性增强效应的影响

取C57BL/6小鼠60只随机分成4组，即对照组、模型组、戒毒一号低剂量组（14.12 g/kg）和戒毒一号高剂量组（56.48 g/kg）。给药组给予相应剂量戒毒一号，对照组和模型组均腹腔注射同体积生理盐水。30 min后，戒毒一号给药组和模型组均腹腔注射METH（2 mg/kg），对照组给予同体积生理盐水，30 min后测定60 min内小鼠的自发活动。

图1 戒毒一号多次给药对小鼠自发活动的影响流程图Fig.1 Testing schedule of multiple administrations of JDYH on locomotor activity in mice

2.4 METH诱导的行为敏化

取C57BL/6小鼠30只随机分成2组，即对照组、模型组。形成期模型组每天腹腔注射METH（2 mg/kg），对照组腹腔注射等量生理盐水，连续7 d。转化期停药7 d无任何处理。表达期即第15天，所有动物腹腔注射METH（2 mg/kg）激发，30 min后测定60 min内小鼠的自发活动。详细流程见图2。

图2 甲基苯丙胺诱导行为敏化流程图Fig.2 Testing schedule of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.5 戒毒一号对METH诱导的小鼠行为敏化形成的影响

取C57BL/6小鼠60只随机分成4组，即对照组、模型组、戒毒一号低剂量组（14.12 g/kg）和戒毒一号高剂量组（56.48 g/kg）。形成期各组动物按剂量灌胃给药，对照组和模型组灌胃等量生理盐水。给药60 min后，戒毒一号给药组和模型组动物均腹腔注射METH（2 mg/kg），对照组给予等体积生理盐水，连续7 d。转化期停药7 d（无任何处理）。表达期即第15天，所有动物腹腔注射METH（2 mg/kg）激发，30 min后测定60 min内小鼠的自发活动。详细流程见图3。

图3 戒毒一号对甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化形成的影响流程图Fig.3 Testing schedule of JDYH on development of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.6 戒毒一号对METH诱导的小鼠行为敏化转化的影响

取C57BL/6小鼠60只随机分成4组，即对照组、模型组、戒毒一号低剂量组（14.12 g/kg）和戒毒一号高剂量组（56.48 g/kg）。形成期除对照组腹腔注射生理盐水外，其他各组动物均腹腔注射METH（2 mg/kg），连续7 d。转化期，停用METH，并分别灌胃生理盐水或戒毒一号（14.12、56.48 g/kg），每日1次。表达期所有动物腹腔注射METH（2 mg/kg），30 min后测定60 min内小鼠的自发活动。详细流程见图4。

图4 戒毒一号对甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化转化的影响流程图Fig.4 Testing schedule of JDYH on transfer of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.7 戒毒一号对METH诱导的小鼠行为敏化表达的影响

取C57BL/6小鼠60只随机分成4组，即对照组、模型组、戒毒一号低剂量组（14.12 g/kg）和戒毒一号高剂量组（56.48 g/kg）。形成期除对照组腹腔注射生理盐水外，其他各组动物均腹腔注射METH（2 mg/kg），连续7 d。转化期停药7 d（无任何处理）。第15天，分别灌胃生理盐水或戒毒一号（14.12、56.48 g/kg），30 min后，所有小鼠腹腔注射METH（2 mg/kg），30 min后测定60 min内小鼠的自发活动。详细流程见图5。

图5 戒毒一号对甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化表达的影响流程图Fig.5 Testing schedule of JDYH on expression of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.8 统计学处理

试验采用SPSS 23.0软件对所得各项数据进行统计学分析，试验结果用±s表示。组间比较采用重复测量的方差分析法、单因素方差分析法和LSD检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。试验结果用Sigmaplot 11.0软件制作成图。

3 结果

3.1 戒毒一号单次给药对小鼠自发活动的影响

如图6所示，与对照组相比，戒毒一号低剂量和高剂量组小鼠自发活动计数差异无统计学意义（P＞0.05）。表明单次灌胃后，戒毒一号低、高剂量均对中枢神经系统没有抑制作用。

3.2 戒毒一号多次给药对小鼠自发活动的影响

结果表明，与对照组相比，戒毒一号低、高剂量组小鼠在第1天、第7天和第15天时，自发活动计数差异均无统计学意义（P＞0.05）。与给药第7天比，给药第15天，戒毒一号低、高剂量组小鼠自发活动计数并未显著升高，表明戒毒一号自身不产生行为敏化效应，结果见图7。

3.3 戒毒一号对甲基苯丙胺引起小鼠高活动性的影响

结果表明，单次给予METH（2 mg/kg），可使小鼠自发活动明显增加（P＜0.01）。在腹腔注射METH前30 min，各给药组灌胃相应剂量戒毒一号，与模型组相比，戒毒一号低、高剂量组小鼠自发活动计数差异无统计学意义（P＞0.05），表明戒毒一号对单次给予METH诱发的小鼠高活动性无显著影响，结果见图8。

图6 戒毒一号单次给药对小鼠自发活动的影响（n=13～15）Fig.6 Effects of a single dose administration of JDYH on locomotor activity in mice

图7 戒毒一号多次给药对小鼠自发活动的影响（n=14～15）Fig.7 Effects of multiple administrations of JDYH on locomotor activity in mice

图8 戒毒一号对急性甲基苯丙胺处理所致小鼠活动效应增强的影响（n=13～15）Fig.8 Effects of JDYH on hyperactivity induced by acute administration of METH in mice

3.4 甲基苯丙胺诱导的行为敏化

结果表明，与对照组相比，模型组在第1天、第7天和第15天时，小鼠自发活动性显著增加（P＜0.01）。且与第1天模型组相比，第7天模型组小鼠活动性显著升高（P＜0.05），表明METH慢性给药小鼠的自发活动性较单次给予METH（2 mg/kg）引起的小鼠活动性增高更明显，而与第7天模型组相比，第15天模型组小鼠活动性也显著升高（P＜0.05），表明2 mg/kg甲基苯丙胺能诱导行为敏化。结果见图9。

图9 甲基苯丙胺诱导的行为敏化（n=15）Fig.9 Behavioral sensitization induced by METH in mice

3.5 戒毒一号对METH诱导的小鼠行为敏化形成的影响

小鼠灌胃生理盐水或戒毒一号，30 min后腹腔注射生理盐水或METH，连续7 d，停药7 d。第15天动物腹腔注射METH（2 mg/kg）激发行为敏化。与对照组相比，模型组小鼠的自发活动计数有显著升高（P＜0.05），表明试验动物已稳定建立了对METH的行为敏化。与模型组相比，戒毒一号低、高剂量组小鼠的自发活动计数明显降低（P＜0.05或P＜0.01），表明戒毒一号可以抑制小鼠METH行为敏化的形成。结果见图10。

图10 戒毒一号对小鼠甲基苯丙胺行为敏化形成的影响（n=15）Fig.10 Effects of JDYH on development of behavioral sensitization induced by METH in mice

3.6 戒毒一号对METH诱导的小鼠行为敏化转化的影响

小鼠慢性METH（2 mg/kg）处理7 d后，第8天至第14天，灌胃生理盐水或戒毒一号。第15天所有动物腹腔注射METH激发行为敏化。与对照组相比，模型组小鼠的自发活动计数明显高于对照组（P＜0.05），表明试验动物对METH的行为敏化已建立。与模型组相比，戒毒一号低、高剂量组小鼠的自发活动计数明显降低（P＜0.05或P＜0.01），表明戒毒一号可以抑制小鼠METH行为敏化的转化。结果见图11。

图11 戒毒一号对小鼠甲基苯丙胺行为敏化转化的影响（n=15）Fig.11 Effects of JDYH on transfer of behavioral sensitization induced by METH in mice

3.7 戒毒一号对METH诱导的小鼠行为敏化表达的影响

小鼠慢性METH（2 mg/kg）处理7 d后，停药7 d。第15天，腹腔注射METH激发行为敏化前30 min，灌胃生理盐水或戒毒一号。与对照组相比，模型组小鼠的自发活动计数明显高于对照组（P＜0.05），表明试验动物对METH的行为敏化已建立。与模型组相比，戒毒一号低、高剂量组小鼠的自发活动计数明显降低（P＜0.05），表明戒毒一号可以抑制小鼠METH行为敏化的表达。结果见图12。

图12 戒毒一号对小鼠甲基苯丙胺行为敏化表达的影响（n=15）Fig.12 Effects of JDYH on expression of behavioral sensitization induced by METH in mice

4 讨论

行为敏化可分为3个阶段：形成期、转化期和表达期，即在反复给予等量成瘾药物干预5～7 d（形成期）后，进行7～14 d的断药处理（转化期），断药结束后的第1天再次给予该药物，并检测动物的自发活动（表达期）。行为敏化效应的形成、转化和表达与药物成瘾导致的反复强迫性觅药和复吸行为密切相关。本试验结果显示，间断、重复腹腔注射METH（2 mg/kg）可以诱导小鼠产生行为敏化，且METH行为敏化小鼠的自发活动性较单次给予METH引起的小鼠活动性增高明显，表明METH引起的行为敏化可能使METH导致的动物高活动性进一步增强。

本研究分别在行为敏化的3个阶段给予戒毒一号干预，观察戒毒一号对METH行为敏化的影响。结果表明，在METH诱导的行为敏化效应的不同阶段给予戒毒一号干预，可影响METH行为敏化的形成、转化和表达，提示戒毒一号对METH成瘾行为的形成、转化和表达有拮抗作用。

本研究发现单次、多次给予戒毒一号对小鼠的自发活动性均无影响，说明戒毒一号自身不产生敏化效应，且无中枢镇静的不良反应，排除戒毒一号通过抑制小鼠活动来达到对行为敏化的抑制作用。研究表明脑内DA系统是与行为敏化有关的重要脑区[7]。目前占优势的观点认为成瘾药物通过激活中脑边缘多巴胺系统，促进了DA的释放并诱导行为敏化效应的发生[8]。研究表明METH通过增强DA合成过程中限速酶（酪氨酸羟化酶）的活性，促进DA的合成与释放，METH还能通过抑制突触内的囊泡单胺类转运和DA的单胺氧化酶活性来抑制多巴胺的代谢，进而升高奖赏脑区内DA的含量，增强DA系统的功能，产生奖赏效应和精神依赖[9-11]。研究表明METH可致海马、前额叶皮层、纹状体等脑区DA含量明显升高，而脑内DA受体兴奋与METH成瘾相关[12-13]，提示甲基苯丙胺行为敏化的形成可能与中枢DA能神经系统的功能增高有关。

戒毒一号中的主要成分延胡索是罂粟科紫堇属植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥块茎，中医认为延胡索辛散温通，具有活血、行气、止痛之功效。现代药理学研究表明，延胡索及其主要成分左旋四氢帕马丁（l-tetrahydropalmaine，l-THP）均能阻滞甲基苯丙胺导致的纹状体、伏隔核、前额叶皮层等脑区中多巴胺受体（dopamine receptor，DAR）的下调，上调多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）的表达，降低DA水平，逆转甲基苯丙胺对DA神经元的损伤，提示延胡索和l-THP治疗精神依赖的机制与其下调升高的DA水平以及上调DAT和DAR的表达有关[14-16]；说明延胡索具有治疗METH成瘾的应用前景，可以通过抑制伏隔核及尾壳核内METH诱导的DA水平的增加来抑制METH引起的行为敏化[17]；表明戒毒一号可能通过调节脑内DA系统功能来抑制METH诱导的行为敏化。戒毒一号中的其他成分被证实对神经系统有镇静[18-19]、催眠[20-21]、抗惊厥[22]作用；具益气补中、生津养血[23-26]、抗炎[27]等作用。本试验中，推测戒毒一号可以提高成瘾者免疫力和身体素质。本试验首次将戒毒一号应用于METH诱导的行为敏化影响的研究，发现戒毒一号对METH行为敏化的形成、转化和表达均有拮抗作用，推测戒毒一号通过多途径拮抗METH引起的DA水平的升高和行为敏化效应，但是其具体作用机制还需进一步深入研究。