不同试剂盒提取质粒中内毒素水平的比较

李卫玲，易初丽

（江汉大学 武汉生物医学研究院，湖北 武汉 430056）

质粒是细菌、放线菌和真菌细胞中一种染色体外双链闭环的DNA分子，以超螺旋状态存在，具有自主复制和转录能力。质粒可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细菌中进行繁殖和表达，是分子生物学试验中常用的工具[1]。

内毒素为革兰阴性细菌细胞壁外膜的主要组成成分脂多糖，是诱发炎症反应过程中主要的致病成分[2]。鲎试剂法作为一种检测疫苗制品细菌内毒素的方法已被列入《中华人民共和国药典》[3]。

由于研究目的不同，对质粒DNA质量的要求也不同，质粒DNA提取试剂盒的选择成为试验顺利进行的关键，但对质粒内毒素水平检测的研究较少。本试验尝试采用鲎试剂显色基质法测定6种不同市售试剂盒提取质粒DNA中的内毒素水平，为质粒DNA提取方案的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pCMV-EGFP购自碧云天生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司。

1.2 试剂

6种试剂盒分别为：1）QIAGEN质粒小提试剂盒 Plasmid Mini Kit（12123）；2）QIAGEN无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree Plasmid Maxi Kit（12362）；3）康为世纪高纯质粒中提试剂盒（CW0502）；4）A厂家无内毒素质粒中提试剂盒；5）B厂家无内毒素质粒小提试剂盒；6）C厂家无内毒素质粒小提试剂盒。6种试剂盒均购自荆楚恒盛生物科技有限公司。鲎试剂（批号170412，λ=0.125 EU/mL，规格0.1 mL）、细菌内毒素检查用水（批号160903，规格2 mL）、细菌内毒素对照品（批号170414，规格15EU）、显色基质鲎试剂盒（含偶氮化试剂，批号170416）购自厦门鲎试剂生物科技有限公司。

1.3 仪器

超净工作台购自苏州净化设备有限公司；恒温气浴摇床购自上海精宏实验设备有限公司；紫外分光光度计购自Eppendorf公司；生化培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；多功能酶标仪购自Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 质粒DNA的提取 准备携带pCMV-EGFP质粒菌液，应用6种试剂盒提取质粒DNA，每组重复3管，具体试验操作参照试剂盒说明书。提取质粒DNA后，应用紫外分光光度计测定DNA浓度（μg/mL）、A260/A280及A260/A230值，用于评价质粒DNA的质量。

1.4.2 鲎试剂灵敏度的复核 参照2015年版《中华人民共和国药典》[3]中细菌内毒素的检测法。用细菌内毒素检查用水将内毒素标准品稀释成0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.030 0 EU/mL的内毒素对照溶液，分别吸取0.1 mL上述溶液，加入待复核的鲎试剂中，每个浓度平行做3管。同时取待复核的鲎试剂，加入0.1 mL细菌内毒素检查用水，作为阴性对照。轻柔混匀，封口膜封住管口，垂直放入37℃温箱孵育40 min。观察凝结情况，并按公式λc=lg-1(∑X/4 )计算鲎试剂实际灵敏度λc。λc在0.5～2.0λ范围内，表示该鲎试剂可用于细菌内毒素的检测。

1.4.3 标准曲线的制作 按显色基质法试剂盒说明书，配好检测试剂和不同浓度的内毒素标准品。取4支试管，加100 μL的鲎试剂溶液。分别取100 μL浓度为1.00、0.50、0.25、0.10 EU/mL内毒素溶液加入试管中，每组重复3管，同时以细菌内毒素检查用水作空白对照管。轻柔混匀，于37℃温箱孵育8 min。加入显色基质液100 μL，混匀，再置37℃温箱孵育6 min。各管均加入0.5 mL偶氮化溶液1号，混匀后继续加入偶氮化溶液2号0.5 mL，混匀后再次加入偶氮化溶液3号0.5 mL，混匀，室温静置5 min，测定545 nm处的吸光度。将内毒素浓度（C）对吸光度（A）进行线性回归，得标准曲线。标准曲线的线性相关系数R2≥0.980时，试验有效。

1.4.4 质粒内毒素水平测定 通过凝胶法半定量测定质粒DNA中内毒素水平。首先将质粒DNA进行稀释，每组重复3管，向鲎试剂中加入0.1 mL的细菌内毒素检查用水混匀，并加入等体积的质粒样品，取2管加入0.1 mL细菌内毒素检查用水作为阴性对照。轻轻混匀，37℃温箱中保温40 min。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到震动造成假阴性结果。

根据鲎试剂显色基质法说明书检测适度稀释后质粒样品中内毒素水平（EU/μg），每组重复3管，显色后测定产物在545 nm处的吸光度值，依据回归方程计算内毒素水平。

1.4.5 统计学分析 采用SPSS Statistics17.0统计学软件进行数据统计分析，各项试验数据均以±s表示。

2 结果与分析

2.1 6种试剂盒提取质粒DNA

上述6种试剂盒的操作步骤均较为简单方便，分别取质粒样品10 μL，用洗脱液作为空白对照，紫外分光光度计测定，记录质粒DNA相关数值。测定结果表明，各试剂盒提取质粒的得率和纯度均符合相应说明书要求，可用于后续内毒素水平测定（见表1）。

表1 6种试剂盒提取质粒DNA测定结果Tab.1 Comparisons of extraction effects of plasmid DNA with six kits

2.2 鲎试剂灵敏度复核和标准曲线制作

将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，制成2.00、1.00、0.50、0.25λ的溶液，按2015年版《中华人民共和国药典》[3]，以细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，对鲎试剂进行λ复核。结果显示，λc=0.05 EU/mL在0.50～2.00λ范围内，符合规定（见表2）。

表2 鲎试剂的λ复核结果Tab.2 Recheck results ofλforLimulusamebocyte lysate

将内毒素标准品的浓度分别调整为0.10、0.25、0.50、1.00 EU/mL，按照说明书操作，测定4个标准浓度在545 nm处吸光度值，结果见表3。将内毒素浓度（C）对吸光度值（A）进行线性回归，得回归方程为A=1.16C-0.11，R2=0.980。结果显示标准曲线符合试剂盒要求，可用于后续结果计算。

表3 标准曲线数据Tab.3 Data of standard curve

2.3 6种试剂盒提取质粒DNA中内毒素水平

分别采用凝胶法和显色基质法检测6种试剂盒所提质粒中内毒素水平。首先取质粒样品，分别稀释后用于检测，记录凝胶形成情况；再选取适度的稀释倍数用显色基质法测定，根据回归方程计算内毒素水平，结果见表4。试验结果表明，上述两种方法检测结果一致。其中，QIAGEN无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒的内毒素残留最低，小于0.125 EU/μg；A、B、C厂家无内毒素试剂盒提取质粒的内毒素水平较低；QIAGEN质粒小提试剂盒提取质粒的内毒素水平仍较高；内毒素水平最高的是康为世纪高纯质粒中提试剂盒。6种试剂盒中标明无内毒素的系列提取质粒中内毒素残留均较低，并且QIAGEN无内毒素质粒大提试剂盒去除内毒素效果最好。

表4 质粒DNA内毒素水平测定结果Tab.4 Determination of endotoxin levels in plasmid DNA

3 讨论

细菌内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外膜的主要成分脂多糖，当细菌裂解时会释放出来[4]。内毒素表面带负电荷、易形成微囊结构的特性，使得几种常用质粒提取方法，如沉淀法、硅基质法、阴离子交换法等[5]，很难将DNA与内毒素彻底分开。

有文献报道，内毒素能显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率[6]。内毒素与DNA竞争转染试剂，影响转染试验中目的DNA的摄取。内毒素还可诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞发生非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。有研究表明，细菌内毒素可降低基因免疫小鼠存活率和产仔率[7]。此外，通过有机试剂Triton X-114反复萃取可以显著降低质粒中内毒素含量[8]。另有报道，ZnSO4、多黏菌素B和γ-环糊精-聚氨酯共聚物可选择性地去除DNA溶液中的内毒素[9-11]。

内毒素能与鲎试剂发生特异性的反应，基于此原理的检测方法主要有凝胶法、浊度法和比色法[12-14]，其中凝胶法速度快、特异性好、操作方便，被各国药典收录。当各种内毒素检测方法得出的检测结果不一致时，以凝胶法为准。凝胶法也存在如判断结果有主观性影响和灵敏度差等问题。有研究表明，鲎试剂检测DNA疫苗可行[15]。显色基质法依据供试品内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量在一定时间内成正相关的原理，其优点是重复性好、灵敏度较高。有文献报道，利用显色基质法可以定量测定质粒中内毒素[16]。本研究选用上述两种方法检测市售6种不同试剂盒提取质粒中内毒素水平，由于检测试剂灵敏度、样品稀释、重复数等限制，试验定量结果也存在一定误差。检测结果表明，市售质粒提取试剂盒提取质粒中内毒素含量不同，其中标明无内毒素的试剂盒均采取了一定的去除内毒素措施。而QIAGEN质粒小提试剂盒较康为世纪高纯质粒中提试剂盒提取质粒中内毒素水平低，是由于阴离子交换柱的特异性较好。如需获得更高纯度质粒DNA，仍需结合色谱纯化技术。

常规酶切、转化、测序及PCR等对内毒素没有要求，但原代细胞转染、敏感细胞转染、悬浮细胞转染、基因治疗研究、基因沉默及显微注射均需要低内毒素质粒。本研究结果为质粒提取试剂盒的选择提供基础。市面上质粒提取试剂盒均能满足大多数的分子生物学研究，6种提取试剂盒提取质粒中内毒素水平不同，使用时应根据实际情况选择。