羊水HPV感染检测方法及临床意义的研究进展

李 桐，宋金维，王建东※

(1.首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100010； 2.北京市西城妇幼保健院妇产科，北京 100054)

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种嗜皮肤黏膜的DNA病毒，最常见的感染部位为生殖器黏膜和皮肤，除此之外还能造成呼吸道黏膜感染，如口咽癌、喉癌、呼吸道乳头状瘤等[1]。HPV亚型众多，现已发现超过100种亚型。根据不同亚型、致病力和致病类型将HPV分为高危型和低危型。高危型HPV多导致宫颈癌、阴道癌，低危型HPV多导致各种皮肤疣、生殖器疣、呼吸道乳头状瘤等。既往HPV的母婴传播途径局限为婴儿经产道时将含HPV的宫颈分泌物吸入咽部而造成咽部黏膜感染。然而临床中发现剖宫产分娩的新生儿也会感染HPV，由此得出HPV的母婴传播不仅仅是经阴道感染，还有宫内感染。妊娠期母体免疫力降低，易感染HPV，可能导致不良妊娠结局并威胁新生儿健康。因此，妊娠期HPV感染的母婴传播途径是非常具有研究意义的。有研究在羊水中检测到HPV DNA，且3例羊水HPV阳性病例中有1例新生儿咽部分泌物HPV阳性[2]。但该研究样本量较少，难以将羊水HPV阳性与新生儿咽部分泌物阳性之间的关系以百分比呈现。但羊水中HPV的发现确实是HPV宫内感染的重要依据，也是研究者将目光转移至宫内感染的转折点。但HPV感染羊水的机制、羊水HPV的检测方法以及HPV感染对母婴的危害需要进一步明确。

1 羊水中HPV感染的机制

研究显示妊娠期HPV感染率明显高于非孕期，其原因大致可以从三个方面考虑：①妊娠期雌、孕激素水平升高致母体免疫力下降，同时母体为避免排斥胎儿呈现免疫耐受状态，使母体易受细菌及病毒的侵害[3]。②妊娠期妇女盆腔血流丰富，阴道分泌物增多，局部环境潮湿适宜HPV生长、增殖[4-5]，③雌、孕激素在感染HPV的组织中形成复合物，与孕酮应答元件结合，造成妊娠期HPV感染风险增高[6]。由此，妊娠期HPV易感性明显高于非妊娠期，妊娠期HPV易感性的增加将直接增加胎儿HPV感染率。现已有部分学者在羊水中检测到HPV DNA，但是HPV感染羊水的机制有待研究。部分研究者认为HPV首先感染胎盘，进一步进入羊水[7]。大部分研究者能在胎盘中检测出HPV，尽管胎盘屏障有一定的阻隔作用，但不能阻止病毒传播。由此认为HPV宫内感染途径主要是血-胎盘途径。邓东锐和闻良珍[8]研究认为HPV的母婴传播途径除产道外还有血-胎盘途径，胎盘HPV传播率为60%，HPV入血，经血液至胎盘，再经胎盘至羊水，胎儿吞咽羊水，造成咽部黏膜感染。然而HPV进入羊水并非一条途径，丁锋等[9]研究认为HPV可通过宫颈上行感染或经血液感染胎盘从而羊水HPV阳性，此外HPV还可经宫颈直接感染羊水。目前HPV进入羊水的途径聚焦于血-胎盘途径和上行感染，具体机制有待进一步研究，但是通过羊水中HPV的检测至少肯定了宫内感染是HPV的传播途径之一。羊水中HPV的发现及机制研究为进一步HPV宫内感染的研究奠定了基础。

2 羊水中HPV感染的检测方法

大多数研究中HPV DNA的检测是通过核酸杂交和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)完成的[10]。最初美国食品药品管理局批准的HPV检测方法是杂交捕获2代(hybrid capture 2，HC2)，HC2通过免疫技术、杂交技术和化学发光技术定性检测HPV，其原理为溶解细胞后使核酸变性释放出单链DNA，制作RNA探针与HPV DNA杂交形成DNA-RNA复合物与携带碱性磷酸酶的二抗结合，由碱性磷酸酶催化底物发光[11]。但HC2为定性检测方法无法对HPV分型，因此在HC2的基础上改进检测方法，将带有生物素标记的引物(GP5+/ GP6+)(bio-GPbt5/6)经PCR技术合成针对不同HPV亚型的探针，多种探针与样本进行反向点杂交从而达到检测目的[9]。丁锋等[9]研究中共合成了HPV6、11、16、18四种探针，分别对母血、脐带血、胎盘母体面、羊水及宫颈分泌物5种样本进行检测，发现其HPV阳性率分别为37.0%、37.0%、40.7%、61.11%、50.0%，各样品间检出率比较差异无统计学意义(P>0.1)。邓东锐等[12]研究中将PCR扩增产物经凝胶电泳筛选出阳性标本，再结合限制性片段长度多态性分析技术将阳性标本进行酶切，可根据片段大小判断HPV亚型。还有学者设计出含高危型HPV L1/E6/E7基因的引物和探针，经过PCR扩增对靶DNA进行13种HPV亚型检测(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，设置基线和阈值，将临界值<37作为阳性标准[1]。目前HPV-DNA检测敏感性及特异性较高的检测方法是Abbott检测，即用GP5+/6+引物对HPV L1区进行扩增，与特异性探针进行杂交，通过荧光信号检测多种HPV亚型[13-16]。不同学者对HPV DNA的检测方法略有不同，但均是以PCR技术和核酸杂交技术为核心，向简单、精确、多HPV亚型测定的方向发展。

虽然已经在羊水中发现HPV，但是关于羊水中检测HPV的研究较少，样本量也不足，因此不同研究可能出现截然相反的结果。Syrjänen等[17]研究显示羊水中、胎膜、胎盘滋养细胞及脐血中均能检测到HPV DNA，以HPV6和11型为主。母亲为HPV感染者，婴儿HPV感染率为20%，婴儿主要为黏膜感染，其中口腔黏膜及生殖器黏膜持续感染率为10%和2%。有研究显示孕妇宫颈分泌物、外周血和羊水HPV DNA检出率分别为35.51%(49/138)、51.11%(12/23)和25.00%(3/12)，羊水中HPV的检出率明显低于宫颈分泌物[12]。Lmm等[18]研究发现妊娠期宫颈HPV检出率为17.5%，羊水中HPV检出率为5.7%，羊水HPV检出率明显低于母体宫颈分泌物。Worda等[19]未在羊水及脐带血中检测到HPV DNA，仅在胎盘中检测到HPV DNA，其检出率为14%(8/56)。Ruffin等[20]对142名孕妇进行羊水穿刺，以PGMY09/11 L1和GP5+/GP6+为引物检测HPV，均未检测出HPV DNA，认为若HPV可以轻易穿过胎盘，那么羊水中总会有一些HPV DNA存在，而142例样本中均未检测出HPV，由此认为HPV不能通过胎盘。目前羊水中HPV的研究结果差异较大，部分学者能在羊水中检测到HPV，但是羊水HPV的检出率明显低于母体宫颈分泌物。

3 HPV感染对妊娠结局的影响

多数学者认为妊娠期感染HPV将增加流产、胎膜早破、早产、胎儿生长受限等不良妊娠结局[21-23]。其作用机制说法不一，主要为HPV感染破坏合体滋养细胞功能增加流产、早产率，HPV感染增加各种妊娠期阴道炎的概率从而增加胎膜早破率。也有学者认为HPV作用于蜕膜，促进释放花生四烯酸并合成前列腺素诱发宫缩，诱发早产[24]。HPV刺激胎膜趋化中性粒细胞，激活多种细胞因子，产生蛋白水解酶将降解胎膜并软化宫颈，诱发胎膜早破、增加早产风险[24]。还有少部分学者认为妊娠期HPV感染不会增加不良妊娠结局发生率[25-26]。

Lmm等[18]在滋养细胞、胎盘绒毛间充质细胞和部分子宫内膜中检测出HPV DNA。有研究发现羊水HPV感染将增加细菌性阴道病和沙眼衣原体感染率，HPV以合体滋养细胞为攻击目标，破坏合体滋养细胞功能，增加流产、早产及胎膜早破率[27-29]。周静等[29]研究发现HPV感染组胎膜早破的发生率高于未感染组(P<0.05)，而不同亚型的HPV对于胎膜早破的影响差异无统计学意义。HPV可以直接侵犯胎膜细胞，也可产生炎症反应诱发其他细菌感染，增加胎膜早破率。Ambühl等[30]研究发现宫颈HPV阳性样本中自发流产率为24.5%，早产率为47%，明显高于正常妊娠组。张静等[31]研究中应用二元Logistic回归分析显示HPV感染是早产及胎膜早破的危险因素(OR=3.323,95%CI2.192～5.036)。蔡际[24]研究中设置观察组(HPV阳性的孕妇)100例，对照组(HPV阴性孕妇)120例，观察组早产、胎儿窘迫、新生儿窒息、新生儿HPV感染率分别为7%、15%、16%、35%，对照组分别为1%、3%、4%、5%，两组比较差异均有统计学意义，由此可见妊娠期HPV感染会增加早产、胎儿窘迫、新生儿窒息、新生儿HPV感染率。

但也有研究显示羊水HPV感染不会增加流产、胎儿畸形、胎膜早破、早产、胎儿生长受限等不良妊娠结局概率，羊水中HPV阳性对妊娠结局及新生儿影响不大[32]。Naresh和Simhan[27]对13例胎膜早破孕妇进行羊水穿刺，检测羊水中单纯疱疹病毒1/2、HPV、巨细胞病毒等多种病毒及细菌DNA/RNA发现羊水样本中各种病毒均为阴性，而细菌呈阳性。因此认为病毒不是导致胎膜早破的因素。Nimrodi等[33]研究显示HPV阳性组(n=201)早产率为7%，HPV阴性组(n=11 261)为8.5%，两者差异无统计学意义。HPV阳性组宫颈机能不全率为1.5%，HPV阴性组为0.5%，两者差异无统计学意义，因此认为HPV感染不增加不良妊娠结局发生率。

4 HPV感染对胎儿的影响

有研究认为孕早期HPV感染生殖细胞有可能造成遗传物质不稳定、染色体异常，从而导致流产、胎儿畸形及胎儿生长受限，可能引起新生儿呼吸道乳头瘤及生殖道尖锐湿疣等疾病。而呼吸道乳头瘤是一种多发、易复发、不易治愈的疾病，多表现为咽部菜花样赘生物、声音嘶哑，严重时呼吸困难[3]。因此，妊娠期HPV的筛查对于婴儿HPV相关疾病的早发现、早治疗意义重大。但也有研究发现虽然妊娠期HPV感染率高，但新生儿呼吸道乳头瘤、结膜乳头瘤等发生率并不高，其原因可能为胎儿、新生儿体内存在HPV抗体。母体感染HPV后血液中会产生HPV抗体IgG,HPV抗体IgG可以通过胎盘屏障进入胎儿体内抵抗HPV，胎儿36周后胸腺T淋巴细胞发育成熟，可通过自身细胞免疫抵抗HPV。此外，婴儿可通过母乳获取IgA抵抗病毒感染[9]。郑晓霞等[1]研究认为HPV感染不增加新生儿呼吸窘迫综合征、胎儿生长受限等发生率，母体感染HPV新生儿HPV阳性率为68.8%，虽然新生儿感染率较高，但婴儿HPV转归较好，产后6个月婴儿HPV阳性率仅为32.8%，产后1年婴儿HPV阳性率为5.4%，产后2年转阴率为100%。虽然新生儿呼吸道乳头状瘤难治愈，易复发，需反复手术治疗，然而婴儿感染HPV后转阴率极高，因此临床上对于妊娠期HPV阳性无需干预。但HPV感染可能增加不良妊娠结局发生率，不良妊娠结局直接影响新生儿健康，因此判断HPV感染对新生儿的影响要从多个角度综合考虑。

5 分娩方式的选择

尽管目前认为HPV存在宫内感染途径，但经阴道分娩使HPV感染率大大增加。并且大部分研究者认为HPV感染能引起新生儿呼吸道乳头瘤及生殖道尖锐湿疣，呼吸道乳头瘤会导致新生儿声音嘶哑、呼吸困难，且咽部黏膜菜花样的赘生物难以治愈、易复发。目前对于HPV阳性的孕妇是否应避免经阴道分娩仍存在争议，Chatzistamatiou等[34]研究发现剖宫产HPV传播率为14.9%，明显低于引导分娩的28.2%，剖宫产能减少46%围生期HPV传播风险，但是不能阻止HPV传播，剖宫产HPV的传播率大约为15%。Mammas等[35]应用PCR技术对190名儿童口咽部HPV感染情况进行研究发现HPV感染率为8.4%，阴道分娩与剖宫产无差异。于松等[36]研究认为HPV阳性孕妇经阴道分娩和剖宫产新生儿HPV感染率分别为64.1%(41/64)和43.2%(16/37)，差异有统计学意义(P<0.05)。虽然剖宫产能降低新生儿HPV感染率，但不能阻止HPV传播。目前大部分学者认为HPV阳性不应成为剖宫产指征[21，32，37-38]：①剖宫产虽能降低新生儿HPV感染风险，但由于HPV存在宫内感染，因此不能阻止HPV的母婴传播。②新生儿感染HPV固然有呼吸道乳头瘤的风险，然而发病率不高，但多数感染能在1年内转阴。③剖宫产较自然分娩存在很大风险，如手术本身存在风险以及再次妊娠有瘢痕子宫破裂等风险，其风险性不低于HPV感染。还有研究认为新生儿HPV感染率为68.8%，新生儿经阴道分娩和剖宫产HPV感染率无差异[1]。部分研究者认为剖宫产能降低HPV传播率，但不能完全阻止其传播[1]。且婴儿2年内HPV转阴率极高，剖宫产术本身具有一定风险，再次妊娠也有子宫破裂等风险，因此HPV感染不作为剖宫产指征。

6 小 结

随着羊水中HPV DNA检测研究的深入，已证明HPV不仅通过产道感染婴儿，还能通过宫内感染影响胎儿健康。HPV感染对胎儿的主要危害在于胎儿吞咽羊水中HPV使咽部黏膜感染直接导致新生儿呼吸道乳头状瘤，不良妊娠结局对胎儿的影响以及婴儿各种皮肤疣、生殖道疣感染等。虽然羊水中能检测出HPV DNA，但欠缺HPV的分型与定量研究，HPV感染与不良妊娠结局、新生儿疾病等关系尚不十分明确。但目前研究显示HPV感染可能增加不良妊娠结局和胎儿疾病发生率。考虑目前研究数目有限，样本量较小，不同学者研究结论差异较大，未将HPV感染列为剖宫产指征，应继续深入大样本的研究，以剖析围生期HPV感染的发生、发展、传播途径及不良后果。