细胞凋亡主要检测方法及其应用

何玉婷，杨 雯，王改琴，张旭东※

(1.长治医学院第一临床学院2015级，山西 长治 046000； 2.长治医学院组织学与胚胎学教研室，山西 长治 046000)

细胞凋亡现象最早由Lockshin等于1965年发现，然而直到1972年Kerr等[1]才初次提出细胞凋亡这一概念。细胞凋亡定义为细胞为维持其内环境的稳态，由基因控制的自主、有序而无炎症性的消亡过程[2]。细胞凋亡过程是细胞主动死亡的过程，涉及基因的激活、表达和调控等事件，由基因严格控制[3]。细胞凋亡的异常会使细胞失去控制，与肿瘤的发生、先天性畸形形成以及神经系统疾病、心血管疾病、免疫系统疾病等疾病的发生发展关系密切[2,4]。细胞在凋亡过程中会出现一系列特征性变化，包括核固缩、核碎裂、凋亡小体形成等形态学变化以及DNA特征性片段化、新基因表达、某些生物大分子合成等生物化学变化[5]。细胞凋亡的检测方法正是基于凋亡细胞特殊的形态学改变和生物化学变化而设计的。近年来，凋亡细胞的判断和机制的产生等方面进展显著，许多细胞凋亡检测的方法得到更广泛的应用。现就近年来细胞凋亡主要检测方法的进展及其应用进行综述，以期为相关研究领域的工作者提供参考与借鉴。

1 细胞凋亡的形态学检测

细胞发生凋亡时会出现一系列独特的形态学特征，如细胞体积变小；核固缩，核仁碎裂，染色质密度增高；胞质浓缩，细胞器密度增高；细胞膜皱褶、卷曲、内陷，并将胞质和DNA分割包裹形成凋亡小体[2,6]。细胞凋亡过程中，凋亡小体被吞噬细胞或邻周细胞识别、吞噬或自然脱落，无溶酶体及细胞膜破裂现象，无细胞内含物外泄发生，周围组织无炎症反应，也无次级损伤[2,6]。借用光学显微镜、电子显微镜或荧光显微镜可不同程度、不同层次地观测到形态学特征。李媛媛和吴洪娟[7]用双氢青蒿素体外诱导人乳腺癌细胞凋亡，借助透射电子显微镜观察到凋亡晚期细胞核膜间隙增大，核膜完整性被破坏；染色质高度浓缩、凝聚，呈半月形或团块状，且堆积在核膜内侧缘或聚集于核中央部；线粒体肿胀，胞质内出现许多空泡和凋亡小体；细胞外可见大量细胞碎片。王宏刚等[8]用吖啶橙、Hoechst 33342等染色剂对DNA特异性染色，借助荧光显微镜、共聚焦激光显微镜清楚地观察到染色质高度凝聚、边缘化，细胞核裂解为碎块等微细结构变化。细胞凋亡形态学检测的方法因简易、直观和定位较好的优点至今仍被使用，但也有不足之处：对结果的判定缺乏特定标准，主观性大，因人而异；不能满足定量的要求；对大样本的检测耗时费力。由于形态学有较大局限性，因而多用于固定组织细胞检测，常作为其他技术的基础[2]。

2 细胞凋亡的DNA片段检测

DNA断裂是细胞凋亡最显著的特点，细胞凋亡时，核酸内切酶将DNA切割为更小的片段，可通过检测DNA片段来检测细胞凋亡。常见的DNA片段检测有琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法、酶联免疫吸附试验。

2.1琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳法是利用具有网格结构的琼脂糖凝胶作为“过滤器”，不同分子量和带电量的核酸和蛋白质等生物结构通过时受到的阻力大小不同，迁移的速度也不同，因此可将其分离[9]。细胞发生凋亡时，Ca2+、Mg2+依赖型核酸内切酶与相关蛋白水解酶被激活，将DNA降解，形成长度为180～200 bp或其整倍数的DNA片段。生理情况下，活细胞DNA不断裂，凝胶电泳为一正常条带；坏死细胞的DNA随机断裂，凝胶电泳表现为弥漫连续模糊的条带；而凋亡细胞的凝胶电泳一般形成等腰梯形条带，这是凋亡具有代表性的重要的生化结果[2,10]。此法操作简单，定性准确，但特异性和敏感性差，只能进行半定量，不可定位检测，且不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。

2.2原位末端标记法 原位末端标记法包括DNA聚合酶或克列诺酶介导的原位缺口平移法以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)，能很好地检测DNA的分步降解。①原位缺口平移法[11]：细胞凋亡时，DNA多聚酶表达外切酶活性，使核苷酸由5′端切向3′端，借助DNA多聚酶Ⅰ(或Klenow)，并用带有标记的游离核苷酸从3′-OH末端连接到断片上以修复DNA，可显示出含有断裂DNA的细胞，可用于细胞凋亡的观察。②TUNEL[12-14]：其原理与原位缺口平移法相似，不同的是TUNEL所需的酶为末端脱氧核苷酸转移酶，该酶修复单链或双链的DNA过程中不需DNA模板，可直接催化3′端的核酸聚合反应，加入带有荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记的核苷酸，发生显色反应后可特异地进行原位凋亡细胞的检测。正常或增殖细胞几乎没有DNA的断裂，因而近乎没有3′-OH 形成，故很少被染色。原位末端标记法对完整的凋亡细胞或凋亡小体进行原位检测，能准确地反映细胞凋亡最典型的生化和形态特征，并可检测出少量凋亡细胞，适用于冰冻切片、石蜡包埋组织切片，以及培养的或从组织中分离的凋亡细胞测定，其敏感性高、操作较简便快捷，是目前应用于检测细胞凋亡的热门方法。需要注意的是，由于细胞坏死时胞内也产生DNA片段，只有广泛的DNA链发生断裂才能说明细胞发生凋亡；该法过程如果处理不恰当极易造成假阳性，且结果受实验者主观影响较大，必须设立阳性和阴性对照，且成本偏高，若与其他方法结合使用可显示出更好的优越性。

2.3酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验是将已知的特异性抗原或抗体吸附在固相载体(如聚丙酰胺、纤维素或聚苯乙烯等)表面并保存其免疫活性，使酶标抗原或抗体有序地在固相表面进行反应的技术[15]。细胞发生凋亡时，DNA发生核小体间的断裂，形成由DNA与组蛋白(包含H、H2A、H2B、H3、H4五组分)紧密结合的核小体单位的片段[2]。酶联免疫吸附试验采用双抗体(抗组蛋白抗体和抗DNA抗体)夹心免疫法检测细胞凋亡后形成的核小体，酶催化后形成有色产物，根据颜色反应的深浅定性定量分析细胞的凋亡情况[2]。此方法所需细胞数量少，敏感性高，凋亡早中晚期均可进行检测，既可定性又可定量，且适合大批量样本的检测，无需特殊设备。缺点是因检测对象是细胞质中的核小体，故细胞裂解的时长应严格控制，否则裂解细胞时间过长则细胞核中的DNA片段也被显色，最终影响检测结果的真实性[16]，另外，也不能进行细胞的组织学定位。

3 流式细胞术

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)可对浮在液相中且分散着的生物细胞进行定性、定量分析与分选，不仅速度快、敏感性和精确度高，而且对于不同细胞发生凋亡进度不同的过程，FCM的检测更准确[17]。FCM检测的信号与酶联免疫吸附试验相似，只是用荧光代替了催化酶。FCM通过检测荧光参数及光射特征来检测细胞凋亡，检测得到的并非单个细胞的凋亡情况，而是对所有加入的悬浮细胞进行凋亡情况统计。工作原理为当待检测的细胞依次排列进入该仪器的液流系统、光学系统，经激光照射，被荧光标记了的细胞向空间各个方向散射光线，其中前向散射光(forward scatter，FSC)强度代表了细胞的大小，而侧向散射光(side scatter，SSC)与细胞颗粒的复杂程度，即细胞内部细胞器及胞质的折射率有关。细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞的FSC降低，SSC增高；相反，正常细胞的FSC增高，SSC降低；而坏死细胞的FSC和SSC同时增高[18]。因此，可区分正常、坏死和凋亡细胞。郭茜茜等[19]认为FCM适用于早、中期凋亡阶段凋亡率的测定。但对于凋亡晚期，相关学者使用FCM的同时配合相关染色剂也得到了满意结果[20]。需要注意的是，细胞胞质是否均一、核与胞质比率差异等均可使检测结果不同，从而影响对凋亡细胞的判断。

3.1细胞周期的测定 一个细胞周期可以人为地划分为G1期、S期、G2期和M期，其中S期、M期为细胞增殖的关键时期，完成DNA的合成及细胞分裂。DNA含量随这4个时期的变化而呈周期性变化[21]。线粒体介导的、膜受体介导的细胞凋亡均与细胞周期密切相关，总是发生在细胞周期的特定时相(如星形胶质细胞凋亡大多发生在G1期、G1期的阻留状态即G0期)，细胞凋亡是细胞周期事件[22]。细胞凋亡后发生DNA断裂，用碘化丙啶(propidine iodide，PI)、苯基吲哚、吖啶橙等染色剂标记DNA，通过FCM分析，可以得到细胞各时期的分布状态，便可计算出G1、S、G2和M期各占多少，以判定细胞凋亡的程度和比率[23]。其缺点是受反应时间、温度等影响，溢出DNA小片段的程度不同，会出现凋亡细胞与非凋亡细胞的重叠峰[14]。

3.2胱天蛋白酶(caspase)活性检测 主要有4种蛋白分子家族参与细胞凋亡机制的发生，包括caspase家族、衔接蛋白、Bcl-2家族和凋亡抑制因子[24]。caspase家族在细胞凋亡的调节和执行中的作用十分关键，其中caspase-3被认为是各种因素导致凋亡的关键酶，生理状态下它以酶原的形式存在，并不表现活性，其活化是细胞凋亡的必由之路，预示着细胞执行凋亡程序的开始，是凋亡进入不可逆阶段的标志[25]。目前，坏死细胞中尚未发现有caspase-3的活化，因此，通过检测caspase-3活力强弱可判断细胞是否凋亡或坏死。检测caspase-3活性方法较多，可借助免疫电泳法、免疫凝胶扩散法等分析caspase-3酶原加工的中间产物和底物水解后的最终产物，或用发色底物法(Trinder反应)合成底物检测酶活力，或将活化的caspase-3还原，在还原体系中加入化学试剂生成显色物质，通过比色法得出还原物质的量，进而计算酶的活性[17]。这些方法再结合FCM可定性和定量检测凋亡细胞，且准确性好、敏感性高、特异性强，但是在凋亡晚期，caspase-3活性大幅下降，因此这种方法更适用于细胞凋亡的早期检测。

3.3磷脂酸结合蛋白V(Annexin V)/PI双染法对凋亡细胞的检测 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称复合神经酸，位于正常细胞膜的胞质一侧，在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面[26]。基于此现象，利用Ca2+依赖性Annexin V可与PS特异性结合，且亲和力高，用Annexin V(荧光素或生物素标记)作为荧光探针，采用FCM或荧光显微镜进行检测，此法敏感性较高，适用于细胞凋亡早中期。不足之处是坏死细胞的PS亦暴露于细胞膜外表与Annexin V结合，出现假阳性，干扰检测结果的准确性。PI为一种核酸染色剂，与细胞核结合将细胞核染为红色。PI不可透过正常的细胞膜，可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜，适用于在排除细胞坏死的前提下细胞凋亡中晚期检测[27]。将Annexin V与PI同时使用，借助FCM分析Annexin V和PI的示色情况，其中Annexin V-/PI-、Annexin V+/PI+、Annexin V+/PI-、Annexin V-/PI+分别表示正常、坏死、凋亡和机械性损伤的细胞[28-29]。该方法的特点是细胞分群明显，结果灵敏，但是为防止造成细胞膜损伤，操作要求严格，费用昂贵。

4 线粒体膜电位变化的检测

线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，Δψm)是指线粒体内膜两侧质子分布不均一而形成的电化学梯度。研究表明，细胞凋亡时，线粒体膜孔道大小及膜电位会发生改变，许多刺激因子可通过线粒体诱导细胞发生凋亡。凋亡早期的细胞，线粒体镜下还未出现显著变化时，实际上其膜电位已经开始改变：膜通透性增加，跨膜电位下降[30-31]。因此Δψm下降被认为是凋亡最早的步骤，如果Δψm被破坏，则细胞凋亡不可逆转[31]。一些亲脂阳离子荧光染料，如罗丹明123、JC-1、DiOC6(3)等可与线粒体基质紧密结合，细胞聚集染料能力的下降程度与膜电位的下降程度呈正相关[32]。细胞凋亡时，线粒体内膜负电位绝对值减小，荧光强度降低，借助FCM以及荧光显微镜均可精确地检测出线粒体跨膜电位的变化情况，可判断细胞凋亡的发生。岳磊等[17]用紫外线照射HeLa细胞后，经罗丹明123染色，荧光强度减弱，Δψm明显下降，认为结合FCM可快速的定性、定量分析凋亡细胞。需要注意的是，Δψm变化的检测属于电化学方法，pH值的改变会影响细胞膜电位变化，在应用时需保持平衡染液pH值前后一致。

5 细胞凋亡相关基因及其产物的检测

细胞凋亡是在基因调控下的细胞自我消亡过程。细胞凋亡时某些基因表达异常产物，这些基因转录翻译出来的产物可促进或抑制细胞凋亡，如细胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)及Fas(Apo-1，CD95)等。线粒体在细胞凋亡的过程中起中心调控的重要作用，病理状态下，其结构破坏以及功能紊乱与细胞凋亡有不可分割的关系[33]。Bcl-2、Bax、Bad、Bak组成的细胞凋亡蛋白家族主要作用在线粒体膜上，其中调控因子Bcl-2和Bcl-xl具有减缓细胞异常凋亡的作用；而Bax、Bad与Bak可加快细胞的凋亡[34]。Apaf-1是诱导细胞凋亡的肿瘤抑制基因，Apaf-1和caspase-9酶原(procaspase-9)与细胞色素C结合后形成的凋亡体可激活procaspase-9，引起caspase(如caspase-3等)一系列反应，从而引发细胞发生凋亡[35]。Apaf-1是C-myc癌基因诱导细胞凋亡的相关因子，参与线粒体途径的凋亡[36]。Fas是一种膜蛋白受体分子，多数分布于细胞表面，少数存在于血液系统。Fas与Fas抗体/配体结合后，促使细胞凋亡[37]。这些相关基因及其表达产物的测定可为细胞凋亡检测提供依据。

6 细胞凋亡的细胞色素C检测

细胞色素C是一种信号蛋白质，生理情况下存在于线粒体内外膜之间，不能自由通过线粒体的外膜。接收到凋亡信号后，细胞色素C可从膜间隙转移至胞质中，在ATP作用下特异地与Apaf-1紧密结合，启动一系列caspase级联反应，从而引发细胞凋亡[35]。蛋白印迹法(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，再利用抗体进行检测的方法。细胞色素C作为蛋白质，可用相应抗体作为一抗进行检测，再进行化学发光反应，从而判断凋亡的发生[38]。

7 细胞凋亡的Ca2+浓度变化测定

细胞的生命活动都离不开Ca2+，Ca2+超载时，心肌细胞的线粒体通透性转换孔开放，细胞色素C等凋亡因子通过线粒体通透性转换孔释放或使线粒体膨胀破裂进入胞质，活化细胞色素C依赖的细胞凋亡通路后激活caspase-3，导致细胞凋亡[39-41]。细胞内外Ca2+平衡与细胞凋亡密切相关，细胞内Ca2+稳态主要是通过内质网来维持的，当平衡被破坏后可引起细胞凋亡[42]。用Ca2+特异性荧光探针，如Rhod-2、Indo-1等对细胞进行标记后，再用FCM或荧光、共聚焦激光显微镜检测。这种方法可以准确地得出细胞凋亡的生理免疫指标，且实验数据说明性较强。

8 小 结

细胞凋亡是一个步骤繁多的过程，在基础实验以及临床诊断中，细胞凋亡的检测占有非常重要的地位。细胞凋亡的检测方法较多，以上均是主要而常用的检测方法，还有一些检测方法，如端粒酶的检测、mRNA水平的检测、乙酰胆碱酯酶的检测及微流体技术等没有列入。每种方法均有其各自的优缺点，在实际应用中，应针对不同凋亡阶段的细胞采用多种检测方法相结合，这样才可以观察到实验细胞真实准确的凋亡结果，从而对该结果进一步深入分析得出相应结论。相信随着科学技术的不断发展以及人类对细胞凋亡机制的探索进一步深入，会出现更多准确性高、特异性强、耗时和耗费少的检测细胞凋亡的新方法。