中性粒细胞和微粒在炎症性肠病中促凝机制的研究进展

曹 旭，张武剑，李 桃

(哈尔滨医科大学附属第一医院群力院区麻醉科，哈尔滨 150001)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)，其发病率和病死率逐年升高[1]，虽然目前认为其发病是由于基因易感性及环境因素共同作用导致的肠黏膜异常炎症应答，但具体机制仍不清楚。IBD是一类病因不明、反复发作的慢性肠道疾病[2]。IBD存在高凝状态和增加的血栓栓塞事件[3]。血细胞和微粒是血液中主要受炎症影响的原始成分，其中巨噬细胞主要通过释放细胞因子和化学介质在IBD中发挥促凝作用。IBD患者内皮功能障碍的机制是肠道局部炎性物质能够损伤微血管内皮细胞，直接和间接激活血小板，从而促进血栓形成。既往文献多以研究IBD与血小板凝血物质及凝血功能变化的相关性为主，研究方向较局限。临床中中性粒细胞在IBD中的作用有争议，一方面介导炎症反应[4]，一方面参与组织修复[5]，因此全面了解中性粒细胞在IBD中的作用及机制尤为重要。现主要对中性粒细胞、中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)和促凝作用明确的微粒在IBD并发血栓栓塞事件中的机制进行全面概述，从而为IBD血栓事件的预防和治疗提供理论基础。

1 中性粒细胞在IBD的作用

中性粒细胞灌注是感染性结肠炎和IBD等急性肠炎的重要标志，肠上皮细胞有分泌趋化炎性因子和诱导中性粒细胞跨上皮迁移的潜能。在IBD活动期，大量中性粒细胞和淋巴细胞灌注到肠黏膜，其中中性粒细胞在IBD炎症进展中发挥不可或缺的作用。一旦中性粒细胞浸润到肠黏膜就会通过释放活性氧类、一氧化氮、溶酶体酶、花生四烯酸代谢物和细胞因子等物质发挥细胞毒性作用，此外，中性粒细胞还能释放NETs杀灭病原体。这些作用对于机体成功地防御肠外病原体和炎症的适当缓解起重要作用。但是这个过程没有被严谨有序地控制好时，中性粒细胞就会被过度激活，成为IBD中重要的促炎、促凝因素。

1.1中性粒细胞主要通过表达组织因子促进血栓的形成 中性粒细胞促进血栓形成的能力在IBD血栓形成中也有重要作用。事实上，中性粒细胞已被证明在小鼠深静脉血栓形成模型中必不可少[6]。此外，在小鼠的小动脉，它们首先被招募到激活的内皮细胞周围，从而促进血小板活化和纤维蛋白生成[7]。Maugeri等[8]研究表明，中性粒细胞激活后表达组织因子。在小鼠模型中，在提睾肌小动脉激光损伤部位的中性粒细胞表达组织因子，并且黏附在内皮表面引起血栓形成[7]。同时，中性粒细胞源性的微粒也表达组织因子。在硫酸葡聚糖处理后的UC小鼠模型中，提睾肌小动脉血栓形成增强和血浆凝血酶-抗凝血酶复合物水平升高，抑制组织因子后所有这些指标明显降低[9]。抑制组织因子也能减少沿结肠静脉黏附的血小板、白细胞的数量和组织损伤，表明组织因子参与肠道炎症的发病机制和相关的血栓性事件[10]。此外，中性粒细胞还可产生中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G两种促凝酶。这些酶能损伤内皮细胞激活血小板，促进血栓的形成。在三氯化铁诱导的血管损伤中，这些酶还能水解组织因子途径抑制物使其失活，从而导致抗凝系统功能减弱[10]。组织因子的增高促进凝血瀑布级联激活和凝血酶生成，凝血酶生成同时也能进一步激活血小板。所有这些过程均增加了IBD患者的血栓形成风险。

1.2IBD患者的中性粒细胞释放细胞外诱捕网 NETs释放是中性粒细胞的一种新的死亡方式，也是中性粒细胞增加病原体杀伤及炎症反应的新方式。中性粒细胞在多种病原体和佛波酯等物质刺激下，产生氧化应激，激活中性粒细胞弹性蛋白酶和肽精氨酸脱亚胺酶4，促使染色质去致密化，颗粒膜和核膜破裂，释放以染色质为骨架结合多种颗粒酶的网状结构到细胞外[11]。自2004年NETs发现以来，其各方面的作用也逐渐被发现。NETs既在病原菌防御中发挥重要作用，也能对宿主引起毒性反应。实际上，研究已经发现NETs可以参与急性胰腺炎、肺炎、肝脏缺血再灌注损伤等多种器官和组织损伤过程，这些过程可能与组蛋白、蛋白酶、活性氧等多种物质有关[12]。探究NETs对肠组织的损伤作用有利于进一步揭示中性粒细胞在IBD发生、发展中的作用机制。炎症是IBD疾病发生和发展的主要表现，NETs是一种连接先天免疫和炎症之间新的识别方式，有研究表明NETs在UC通过呈递白细胞介素1β介导活动时期的肠损伤，通过携带组织因子促凝，而在CD的肠组织中无NETs的存在[13]。体外研究表明，NETs破坏培养的人肠上皮样细胞Caco-2/TC7细胞的F-肌动蛋白细胞骨架[14]，然而在IBD动物模型中，NETs对分离的肠上皮细胞和体内肠上皮的损伤作用以及具体机制并不十分清楚。此外，NETs也能与巨噬细胞、T细胞等相互作用，刺激其释放炎性因子等介质加重炎症反应。

1.3中性粒细胞释放细胞外诱捕网促进IBD的血栓形成 NETs是以染色质纤维为平台，网络颗粒蛋白如中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶或高迁移率族蛋白B1，这些成分负责NETs的促炎症促凝血性能。NETs虽然能诱捕病原体和防止其传播使暴露于高浓度的抗微生物因子，但也能够诱导血小板黏附、活化和聚集，促进血栓形成。NETs参与血栓形成，通常是由配体结合中性粒细胞Toll样受体2和4或IgG复合物的受体[15]。体外研究表明NETs可以通过血小板依赖和非依赖方式参与凝血系统的激活，还能网络并激活血小板、红细胞等，为血栓形成提供平台和支架；体内实验表明NETs参与动物多种实验性血栓模型和人静脉血栓等的形成[16-17]。此外，NETs形成的标志物与人冠状动脉粥样硬化严重性相关并为促栓状态提供证据。NETs也参与体内静脉和动脉血栓形成过程。

2011年有研究发现IBD患者肠组织中可能存在NETs[18]，2015年IBD杂志发表的一篇研究表明，通过蛋白组学分析发现在UC患者组织标本中有11种与中性粒细胞以及NETs有关的蛋白质升高，包括髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶G[19]。这些数据已通过显微镜观察到得以验证，并显示在成人UC患者而不在CD患者的肠组织中存在[13]，而在儿科的UC和CD患者小肠和结肠组织中均有大量NETs[20]。CD的危险因素(抗生素相关的肠道菌群失调、肠微生物)在动物模型中能刺激更多的NETs释放[21]。He等[22]也提出NETs是IBD高凝状态的原因，IBD患者中性粒细胞在体外刺激后，相比于对照组能释放更多的NETs。在同一项研究中，活动性疾病患者血清处理中性粒细胞，NETs释放率升高。表明这些IBD患者拥有能够诱导NETs生成的血清微环境。这可能是由于患者血清中的抗中性粒细胞胞质抗体能够刺激中性粒细胞释放NETs。抗中性粒细胞胞质抗体实际上是针对NETs成分，如髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G或蛋白酶3的抗体。在系统性红斑狼疮中，抗中性粒细胞胞质抗体可能会引发NETs释放，通过暴露中性粒细胞抗原参与抗中性粒细胞胞质抗体产生的放大反应。NETs除具有促进血栓形成的表型外，也有助于小血管炎[23]和纤溶亢进[24]，引起IBD肠道组织损伤和随后的出血。因此，NETs可能还在胃肠道出血中发挥重要作用。

基于以上研究推断，NETs可能参与IBD组织损伤、炎症进展和高凝状态等过程，进一步探究NETs参与IBD的机制有助于深入发掘先天性免疫在IBD中发挥的作用，为IBD的治疗提供新方向。

2 微粒在IBD中的作用

当血管内的细胞(包括血液细胞及内皮细胞)被激活、损伤后或发生凋亡时，就会有直径为0.1～1.0 μm的微囊泡从细胞膜脱落，这些释放入血的小囊泡称为微粒。微粒携带该微粒来源细胞的部分蛋白，所以具有相应母细胞的表型和功能。微粒既能发挥一定的生理和病理功能，又能作为一种标志物，反映细胞的激活和疾病的进展状态，它的一些生物学活性与疾病的发生、发展息息相关。目前，微粒主要功能有促凝、促炎、调节免疫等，此外它还能作用于内皮细胞，诱导血管生长、调节血管收缩。循环微粒水平在各种心血管疾病、慢性炎症性疾病中升高，并发挥一定的作用。微粒也是IBD中重要的促炎、促栓因素。对于它的认识还在不断的探索，其研究也越来越多。微粒的研究对进一步认识炎症性疾病IBD的发生、发展和血栓栓塞性并发症的防治具有重要临床意义。

2.1IBD患者微粒水平增高 2005年Chamouard等[25]首次发现CD患者总的循环微粒升高，而且释放的微粒与CD相关的炎症反应有关，治疗疾病的特效药英夫利昔单抗也能显著降低微粒水平。根据微粒的来源将微粒分为血小板微粒、粒细胞微粒、红细胞微粒、内皮微粒及淋巴细胞微粒等。血小板微粒和内皮细胞微粒占循环微粒的主要部分，所以其研究较多，但白细胞微粒在炎症方面的作用也逐渐被广泛认识到。与健康人相比，活动CD患者总循环微粒、血小板微粒、粒细胞微粒、内皮微粒均增加，总的微粒在活动性患者中比非活动性明显增高，而且与炎症的活动性指标红细胞沉降率、C反应蛋白相关。

2.2微粒在介导IBD炎症中的作用 在IBD中，体内分离和体外诱导血小板产生的血小板微粒能够提高肠道环加氧酶2的表达，增加活性氧类的产生，从而加重炎症反应[26]。Andoh等[27]发现，循环血小板微粒水平与IBD临床活动性和血小板聚集活性相关。这些结果表明，血小板微粒是IBD患者血小板活化状态有用的标志物。同时，活动期IBD高水平循环血小板微粒表明，血小板在IBD发病机制中发挥重要作用。内皮细胞微粒是第二大循环微粒。它主要通过内皮细胞的活化或凋亡产生。在IBD中，内皮细胞微粒能够增加血液的高凝状态，促进肠道炎症反应，还能调节血管张力，这与内皮细胞微粒表面表达的相关活性分子有关[28]。Leonetti等[29]将从CD患者外周血提取的微粒注射到正常的小鼠，结果发现小鼠主动脉内皮依赖性血管舒张和肠系膜小动脉血流诱导的扩张功能受到损伤。一氧化氮合酶抑制剂能逆转这种损伤，这与一氧化氮、活性氧类和环加氧酶代谢产物释放之间平衡的微妙改变有关。说明CD患者的微粒能大大改变内皮和血管功能，因此微粒可能在CD的发病机制中发挥作用，至少部分导致不可控制的血管炎症相关的肠道损伤。

2.3微粒促进IBD高凝状态 微粒通过带负电荷的磷脂表面和促凝蛋白如组织因子暴露促血栓形成。新的证据表明，血细胞微粒可能导致IBD的血栓前状态[29]。暴露于血液中的组织因子是外源性凝血途径的始动因素，是主要的启动凝血因子。组织因子作为外源性凝血途径的启动者，在IBD患者肠黏膜损伤后，内皮下组织因子暴露增多[30]。而肠外血栓形成的组织因子来源于循环血细胞表面表达和微粒释放。在对组织因子阳性微粒研究中，IBD患者较对照组增高，虽然Palkovits等[31]得出组织因子阳性微粒与患者高凝状态(D-二聚体水平)不相关。但大部分研究表明，来自肠道血管内带有组织因子的微粒进入全身循环是炎症导致血栓形成的发病机制之一[27-30]。而He等[22]用敏感的磷脂酰丝氨酸探针乳黏素，证明活动性IBD的总磷脂酰丝氨酸阳性微粒和血小板微粒明显增高，并且微粒表面暴露的磷脂酰丝氨酸在IBD高凝状态及血栓形成中发挥主要作用。在儿科胃肠病研究中，Deutschmann等[32]研究表明微粒的促凝活性在活动性、静止性CD和活动性UC患者中显著增高，来源于IBD儿童患者微粒的凝血酶生成能力明显增高，它可能是通过微粒表面表达组织因子或循环血细胞传递组织因子到血栓部位引发肠外血栓形成的[33]。

凋亡的细胞及活化的血小板均产生微粒，在急性冠状动脉综合征中，Mallat和Tedgui[34]利用膜连蛋白Ⅴ与微粒表面的磷脂酰丝氨酸结合的特性分析急性冠状动脉综合征外周血中微粒升高的意义，表明外周血中微粒水平增高有利于预测血栓形成及心肌缺血。提示微粒也能预测IBD患者血栓及肠溃疡形成。

3 结 语

IBD患者发生心血管并发症的最可能原因是IBD疾病本身相关的炎症，而这种高凝状态和血栓动态反过来参与慢性肠道炎症的发生、发展过程。通过靶向降低血小板和白细胞数量和微粒水平，抑制NETs的生成，能进一步预防和治疗IBD血栓栓塞的发生。阐明IBD中高凝状态的机制不仅有利于防治血栓并发症的发生，也有利于控制疾病炎症状态和进一步发展。认识到炎症和凝血之间在IBD中的联系，有助于深入发掘凝血系统在IBD中发挥的作用，为IBD的治疗提供新方向，靶向减少炎症-凝血的相互作用，有利于降低IBD患者发病率和病死率。