环状RNA在免疫应答及肺部感染性疾病中的作用

张梦洁，缪红军

(南京医科大学附属儿童医院急诊/重症医学科，南京 210008)

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，其结构稳定、高度保守，具有组织特异性和发育阶段特异性。circRNA作为基因组中调节基因研究的热点，具有非常复杂的生物学功能，包括作为微RNA(microRNA，miRNA)海绵、调控亲本基因表达、结合RNA结合蛋白、编码蛋白质等重要功能。研究证实，大量稳定且保守的circRNA在人类细胞基因表达调控中扮演着重要角色[1]。近些年越来越多的研究发现，circRNA在肿瘤、神经系统疾病、动脉粥样硬化、糖尿病等疾病的发生发展中起着重要的调控作用，其在一些肺部感染性疾病中也呈差异性表达[2-4]，其原因可能与circRNA直接或间接作用于miRNA，参与调控免疫反应、巨噬细胞极化以及抵抗病原微生物感染等有关。目前circRNA在感染性疾病中的研究尚不多，但已引起了众多研究者的注意。现就circRNA的特征与生物学功能及其在免疫应答调控、抗病毒免疫以及肺部感染性疾病的中的研究进展进行综述，以期为肺部感染性疾病的研究与防治提供新视角和新策略。

1 circRNA的特征及生物学功能

1.1circRNA的特征 1976年，Sanger等[5]首次提出了circRNA的概念。早期，circRNA被认为是错误剪接的产物，因而在很长一段时间内关于circRNA的研究一直处于停滞状态。近年来，随着RNA测序和生物信息分析技术的飞速发展，科学家们对circRNA进行了更深入的研究。研究证实,circRNA具有以下特征：①circRNA是一类具有闭合环状结构的RNA，与传统线性RNA相比，无游离的5′端和3′端，不易被核酸外切酶RNase R降解，具有结构稳定性；②数量庞大，具有一定的组织特异性；③富含miRNA结合位点；④外显子来源的circRNA占大部分，并主要在细胞质中发挥功能，小部分内含子来源以及外显子与内含子组成的circRNA主要在胞核内发挥调控作用[6-9]。

1.2circRNA的生物学功能 近年来,关于circRNA生物学功能的报道越来越多，主要集中在与miRNA调控的关系上。circRNA上具有丰富的miRNA结合位点，能够竞争性结合miRNA，起到miRNA海绵体的作用，从而解除miRNA对靶基因的抑制作用，增加靶基因的表达水平[10]。小脑退行性相关蛋白基因1(cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1)反义链转录生成的circRNA分子CDR1as/ciRS-7广泛存在于人和小鼠的大脑中，ciRS-7含有73个miR-7结合位点，与miR-7海绵吸附后可明显抑制miR-7的功能，同时也可使miR-7作用靶点的表达水平明显增高[11]。另外研究发现，部分circRNA具有与蛋白质相互作用、调控亲本基因表达、编码蛋白质以及作为反转录转座子调控基因表达等生物学功能[12-14]。circ-叉形头状转录因子O亚型3(forkhead box O 3，FOXO3)能够与细胞周期蛋白依赖性激酶2、p21形成三元复合物，抑制细胞周期进程[13]。而circ-FOXO3与MDM2(murine double minute 2)结合可促进p53的泛素化和降解，并抑制FOXO3蛋白的泛素化和降解，从而抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡[15]。

2 circRNA在免疫细胞中的表达和调控

巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，是机体固有免疫的重要组成部分，最早产生于胚胎发育时期的卵黄囊和肝前体细胞，后进入肺部并定居，形成肺泡巨噬细胞，而肺泡巨噬细胞是肺组织的首要防线[16]。在肺部感染性疾病如急性肺损伤等的发生发展中，巨噬细胞发挥着促炎和抗炎双重作用。而近期研究发现，circRNA在巨噬细胞中丰富表达，并参与调控巨噬细胞的促炎和抗炎作用[17-19]。

巨噬细胞受到微生物病原体、脂多糖等特定因素刺激后特异性表达circRNA，如人单核细胞源性巨噬细胞感染结核分枝杆菌后circRNA显著差异性表达[20]；小鼠巨噬细胞受脂多糖刺激后特异性表达circRNA——mcircRasGEF1B，并以核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)依赖的方式表达[17]。在脂多糖/Toll样受体4信号通路中，mcircRasGEF1B可正向调控细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达，而敲除mcircRasGEF1B降低了脂多糖诱导的ICAM-1的表达[17]。ICAM-1对于白细胞向炎症部位的募集至关重要，在炎症反应中发挥关键作用。进一步研究发现，mcircRasGEF1B与细胞周期进程、有丝分裂、活性代谢、NF-κB、脂多糖信号通路以及巨噬细胞极化有关[21]。以上研究支持circRNA在巨噬细胞中参与调节免疫反应、巨噬细胞极化以及抵抗微生物感染。

circRNA参与调控巨噬细胞产生细胞因子。Deng等[18]发现，mmu_circRNA_007893在降钙素基因相关肽刺激后显著上调表达,沉默mmu_circRNA_007893，降钙素基因相关肽诱导的白细胞介素(interleukin，IL)-6信使RNA的表达显著下降，但mmu-miR-485-5p的表达显著增加；而过表达mmu-miR-485-5p，IL-6信使RNA的表达显著下降。上述研究表明，mmu_circRNA_007893可能作为mmu-miR-485-5p的海绵，调节下游炎性因子IL-6信使RNA的产生。因此，mmu_circRNA_007893具有促进巨噬细胞炎症反应的作用。

巨噬细胞受局部微环境刺激后会被激活并极化成不同亚型，发挥不同的功能。巨噬细胞亚型(M1型巨噬细胞和 M2型巨噬细胞)在特异性免疫应答的诱导与调节以及疾病的发展和恢复中起关键作用。M1型巨噬细胞可由γ干扰素、脂多糖等诱导产生，有促进炎症反应和细胞毒作用，其也参与肿瘤的抑制和免疫刺激，但不受调控的过度产生可导致机体正常组织的炎症损伤[22]。M2型巨噬细胞可由IL-4、IL-10、IL-13、糖皮质激素等诱导产生，主要发挥抗炎作用，有促进损伤修复和组织再生的功能[23]。因此，若能选择性激活M2型巨噬细胞会减轻炎症症状并促进组织修复。Zhang等[19]研究表明，circRNA参与调控巨噬细胞的极化，通过微阵列分析技术比较巨噬细胞在不同极化条件下(M1和M2)circRNA的表达谱，共筛选出189条差异表达的circRNA，表明circRNA的表达在不同极化条件下不断改变，且circRNA-010231与miR-6950-5p、miR-19-2-5p、miR-141-5p、miR-1964-5p以及miR145a-3p有结合位点，故推测circRNA可能通过与miRNA相互作用，参与调节巨噬细胞极化。因此，了解circRNA与miRNA相互作用调控巨噬细胞极化的具体分子机制，对未来选择性激活M2型巨噬细胞，减轻炎症损伤具有重要意义，为肺部感染性疾病(如急性肺损伤等)的防治提供新视角。

3 circRNA参与抗病毒免疫反应

最近，有研究揭示了circRNA在诱发抗病毒免疫反应中的新功能，这或许为未来研究病毒性肺炎的诊断与治疗提供了新见解。在转染体外纯化的circRNA到哺乳动物细胞时发现，circRNA可诱导先天免疫基因的表达，从而保护宿主免受病毒感染[24-26]。视黄酸诱导基因Ⅰ是识别外源circRNA的重要核酸传感器，其对circRNA的识别是先天免疫信号的关键。这种识别激活了先天免疫反应，并提供了抵御病毒感染的保护措施。在宿主抗病毒防御系统中，视黄酸诱导基因Ⅰ、黑色素瘤分化相关基因5以及Toll样受体3等双链核糖核酸结合蛋白是宿主抗病毒防御系统的关键因子，这些蛋白质将病毒RNA螯合在抗病毒效应分子上，从而引发抗病毒免疫应答。

Li等[27]使用全基因组文库筛选与circRNA生物合成相关的基因，其中包括与抗病毒免疫相关的免疫因子NF90/NF110。NF90/NF110在宿主对病毒感染的免疫防御中起重要作用，其在细胞核中通过结合环化外显子两侧的内含子促进circRNA形成，在细胞质中与成熟的circRNA相互作用[28]。病毒感染后，NF90/NF110迅速从与circRNA结合形成的circRNP中释放出来，并从细胞核转出至胞质，使细胞核内NF90/NF110的表达显著降低[28]。NF90/NF110可通过与病毒信使RNA结合而抑制病毒的增殖、复制，从而发挥抗病毒的免疫功能[28]。这些发现为circRNA与细胞免疫因子间的相互作用提供了重要线索，证实了circRNA在免疫调节和病毒感染中的作用，circRNA可用于增强免疫激活，也可用于抗病毒治疗。然而，circRNA在抗病毒免疫中的作用尚不完全清楚，需要进一步研究，以充分阐明circRNA与宿主免疫系统在抗病毒防御反应中复杂的相互作用。继续研究circRNA在抗病毒免疫中的作用，不仅可以提高对circRNA生理功能的认识，而且可以为病毒性肺炎提供新的治疗策略。

4 circRNA与肺部感染性疾病的关系

circRNA独特的性质和功能引起了研究者极大的兴趣，circRNA的突变或异常表达在一系列疾病中起重要作用，其在肿瘤细胞中的作用研究最为成熟[29]。现有证据表明，circRNA的表达谱会随着肺部感染性疾病的进程而发生变化[2]，国内外大量学者针对circRNA参与肺部感染性疾病的机制及靶向治疗进行了探索。

4.1肺结核 目前在肺部感染性疾病中，对circRNA与结核分枝杆菌感染研究得最多。宿主防御结核分枝杆菌感染需要启动先天免疫应答和细胞免疫应答，但circRNA是如何通过调控免疫应答抵抗结核分枝杆菌感染的尚需进一步研究。目前关于结核分枝杆菌感染与circRNA的研究主要集中在生物标志物上。Huang等[20]采用高通量测序技术检测了结核分枝杆菌感染后人单核细胞源性巨噬细胞中circRNA的表达情况。该研究首次证明，人单核细胞源性巨噬细胞感染结核分枝杆菌后circRNA的表达发生了变化，并提出hsa_CIRC_0043497和hsa_CIRC_0001204是诊断结核病的有效生物标志物。随后Qian等[2]发现，在活动性肺结核患者中，多个通路内circRNA的表达发生异常，包括细胞因子-细胞因子受体、趋化因子信号通路、神经营养素信号通路等，基于这些通路内差异表达的circRNA，选择肺结核患者中7条差异表达的circRNAs作为7-circRNAs肺结核分子标志物，并在一个独立队列中(11例健康人和10例肺结核患者)验证了7-circRNAs具有区分结核病患者与健康人的能力，且结核病患者与健康人的结核病指数的受试者工作特征曲线下面积为0.946(95%CI0.880～0.951，P<0.001)[20]。因此，7-circRNAs可作为诊断结核病的可靠的生物标志物。此外，研究发现，hsa_circ_0005836和hsa_circ_0009128在活动性肺结核患者外周血单核细胞中的表达也较正常对照组显著下调，hsa_circ_0005836和hsa_circ_0009128也可能成为结核感染的一种新的潜在的生物标志物[4]。有研究发现，血浆hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024的表达水平与肺结核严重程度呈正相关，hsa_circ_0001953与hsa_circ_0009024联合诊断肺结核的受试者工作特征曲线下面积为0.915，治疗后患者血浆hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024水平显著降低(P<0.001)[30]。因此，hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024可以作为诊断肺结核的可靠的新型生物标志物。以上研究证实，circRNA参与了结核病的病理过程，其可作为结核病感染的候选生物标志物，为结核病的诊断开辟了新的方向。

除作为生物标志物外，还有研究探讨了circRNA在肺结核发病机制中的分子调控网络[3]。几种途径包括肿瘤细胞内吞途径、促分裂原活化的蛋白激酶信号通路、人类T细胞白血病1型病毒感染以及泛素介导的蛋白水解信号通路等可能在结核的发病过程中发挥重要作用[3]。其中，促分裂原活化的蛋白激酶信号通路通过增强抗结核分枝杆菌的活性以及产生肿瘤坏死因子α、IL-6、IL-8等炎性细胞因子来防御结核分枝杆菌感染[31]，因此circRNA可能通过促分裂原活化的蛋白激酶信号通路参与调控结核的发生、发展。该研究还预测，circRNA可能充当miRNA海绵调控结核感染，并构建了circRNA-miRNA-信使RNA网络图，为未来进一步研究circRNA抵抗结核分枝杆菌感染的分子机制提供有用信息[31]。

4.2急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) 有学者探索了内毒素感染后circRNA的表达情况。在脂多糖诱导的大鼠ARDS模型中，分别有395条和562条circRNA显著上调和下调[32]。研究证实4条上调的circRNA(mmu_circRNA_19423、rno_circRNA_010489、rno_circRNA_011426、mmu_circRNA_30664)和1条下调的circRNA(rno_circRNA_005564)与表达谱的差异趋势一致，在rno_circRNA_010489的靶miRNA中，miR-34c-5在脂多糖诱导的急性肺损伤中显著下调[33]。另有研究发现，miR-34c-5p的表达在小鼠流感肺炎模型中下调[34]。因此，可以假设rno_circRNA_010489可作为miRNA的海绵在ARDS的发生、发展中发挥调控作用。

尽管许多关于ARDS的研究都集中在发病机制和治疗的潜在目标上，包括miRNA对ARDS的影响，但是circRNA在ARDS发病机制中的作用及其对ARDS发病机制的总体贡献仍然未知。目前的研究结果还是初步的，需要进一步精心设计大样本的纵向研究，以证实circRNA是ARDS潜在的生物标志物和治疗靶点。

4.3病毒性肺炎 儿童病毒性肺炎常由呼吸道合胞病毒感染导致，其他如腺病毒、单纯疱疹病毒、副流感病毒、巨细胞病毒、鼻病毒以及柯萨奇病毒等也可引起病毒性肺炎。有学者研究了单纯疱疹病毒1(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染人胚肺成纤维细胞后circRNA的变化，结果发现了大量病毒反应性circRNAs，并预测其在circRNA-miRNA-信使RNA调控轴中的潜在机制[35]。尽管对circRNA、miRNA和信使RNA的综合分析预测了circRNA的潜在作用，但是circRNA在HSV-1感染中的具体作用尚未通过实验验证。因此，未来的研究应集中在circRNA在HSV-1感染病因学中的调节作用和机制。

有研究提示，miRNA在呼吸道合胞病毒、腺病毒感染后差异表达[36-37]。miRNA在呼吸道合胞病毒感染的婴儿的外周血和呼吸道上皮中异常表达，并参与了免疫细胞极化的调节[36]。同样，在腺病毒感染的儿童中，全血miRNA显著差异表达，并参与了促分裂原活化的蛋白激酶信号通路和先天免疫反应[37]。因此未来需要证实，circRNA作为miRNA的海绵是否参与调节这些病毒的感染，是否可作为病毒性肺炎诊断的标志物。

5 小 结

circRNA是具有高度稳定性、物种保守性以及细胞、组织特异性的非编码RNA，与其他RNA类型相比，这些特性使circRNA有可能被用作更理想的生物标志物和更合适的潜在治疗靶点。circRNA不仅在免疫细胞中丰富表达，还在感染及免疫调节中扮演着举足轻重的作用，可通过与miRNA相互作用参与调节巨噬细胞的极化作用，也可以诱导先天免疫基因表达，从而保护宿主免受病毒感染。circRNA作用机制错综复杂，其究竟通过何种方式调控肺部感染性疾病的发生、发展还有待深入，以期为今后感染性疾病的预防、诊断及治疗提供新的思路和应对策略。