线粒体DNA-Toll样受体9通路介导的炎症反应

杨 丹，孙慧林，胡 喆，唐 靖

(广东医科大学附属医院麻醉科，广东 湛江524000)

当机体受到细菌、病毒或创伤刺激等外源性病原相关分子模式或机体受损时释放的损伤相关分子模式(damage-related molecular patterns，DAMPs)刺激时，可通过Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)等模式识别受体，诱导自身免疫或免疫耐受。TLRs家族是一种系统遗传保守的天然免疫介质，对微生物的识别至关重要，哺乳动物TLRs是一个具有丰富的细胞外亮氨酸重复序列和胞质Toll/白细胞介素(interleukin，IL)-1受体同源域的大家族[1]。TLR9是TLRs家族中的一员，是一种内体DNA识别受体，主要在骨髓细胞中表达，并被微生物病原体相关分子模式和哺乳动物DAMPs激活[2]。人类线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一个16 569 kb的环状DNA，编码rRNA和tRNA以及13个呼吸链亚基，包含一个非编码环，含大量非甲基化的二核苷酸片段，称为CpG岛[3]。mtDNA与细菌DNA同源，与细菌DNA相似，均具有大量未甲基化的CpG DNA序列，可引起与细菌感染相似的炎症反应[4]。研究表明，mtDNA作为一种DAMPs，不仅促进抗菌免疫和调节抗病毒信号，还有助于细胞损伤和应激后的炎症性疾病[5]。现就mtDNA-TLR9通路介导的炎症反应予以综述。

1 mtDNA释放的机制

钙离子吸收可以引起线粒体形态和功能活动的剧烈变化，通过线粒体内膜开放的非特异性孔隙(即线粒体通透性转换孔)引起mtDNA释放[6]。线粒体通透性转换孔是由位于线粒体内外膜接触点的几种蛋白结合而成。线粒体既是氧化剂的主要来源，也是氧化剂破坏作用的靶点，在受到DAMPs刺激时，活性氧类(reactive oxygen species，ROS)产生增加，使线粒体膜电位降低，导致膜完整性受损，mtDNA产生增加，释放到胞质及细胞外[7]。由于mtDNA缺乏组蛋白的保护，并接近电子传递链，很容易受到ROS的攻击。Mito-TEMPO(mitochondria-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy)(是一种线粒体靶向抗氧化剂，具有超氧化物和烷基自由基清除能力)通过清除ROS减少mtDNA的释放和对组织的损伤。环孢霉素A是线粒体通透性转换孔抑制物，可通过阻止线粒体通透性转换孔的诱导和线粒体DNA片段的释放，阻止下游的炎性信号转导；还有研究表明，在脓毒症及其他炎性条件下，血小板通过释放促炎性囊泡等微颗粒，也会导致mtDNA增多[8]。血小板在激活时也会分泌线粒体，线粒体膜磷脂进入细胞外后，可被血清分泌的磷脂酶A2-Ⅱa水解，引起mtDNA的释放；另外，细胞的坏死性凋亡也会引起mtDNA的释放，在一项小鼠实验中发现，输血可导致细胞外的mtDNA释放增加，并引起血管内皮细胞的坏死性凋亡[9]。

2 线粒体DNA引起TLR9激活的髓样分化蛋白88依赖的信号通路

2.1mtDNA-TLR9-髓样分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)-促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 当机体受到损伤性刺激和病毒细菌感染性刺激时，线粒体损伤释放出的mtDNA可通过TLR9激活人多形核中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞，并通过招募MyD88，促进这些免疫细胞的p38 MAPK磷酸化，引起IL-8的分泌和中性粒细胞的趋化作用，从而发挥机体的抗炎作用，减轻组织损伤，这与脂多糖刺激TLR4配体激活有协同作用，均是通过MyD88依赖的信号通路，激活下游的MAPK，继而引起一系列炎性因子的释放，发挥先天免疫调节作用[10-11]。创伤或失血性休克也可导致mtDNA释放且进入循环系统，并通过TLR9激活人多形核中性粒细胞p38 MAPK，使肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-6等炎性因子释放增加，提示mtDNA在休克后可能作为危险相关的分子模式或警报蛋白，导致全身炎症反应综合征及器官损伤的发生[12]。

2.2mtDNA-TLR9-MyD88-核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) mtDNA激活TLR9引发炎症反应的另一条通路是招募MyD88引起NF-κB激活并触发先天免疫应答。在急性心肌梗死导致的无菌性炎症中，循环中的mtDNA释放增加，通过激活TLR9受体，激活NF-κB，导致心肌细胞损伤[13]；脂多糖诱导的脓毒症所致的肺损伤中，mtDNA释放增加，通过调节TLR9识别 MyD88/NF-κB通路可以放大细菌感染引起的全身炎症反应综合征[14]。因此，探讨阻断mtDNA在脓毒症肺部炎症放大的有效途径是脓毒症致肺损伤治疗的另一个关键。有研究表明，慢性心力衰竭与血浆或血清中的促炎因子表达增高密切相关，患者血浆来源外泌体中的mtDNA增加，mtDNA通过TLR9激活NF-κB，引发炎症反应，TLR9抑制剂氯喹可以阻断这种作用[15]。Foley导管损伤膀胱导致mtDNA释放，中性粒细胞向膀胱腔迁移，引起TLR9和NF-κB激活，mtDNA/TLR9/NF-κB炎症轴的改善可能作为预防炎症和膀胱组织损伤的治疗靶点[16]。这种新的炎症通路可以为包括慢性心力衰竭在内的多种炎性疾病的治疗提供一种可靠的途径。

2.3mtDNA-TLR9-MyD88-干扰素调节因子(interferon-regulatory factor，IRF)7 mtDNA还可通过激活TLR9招募MyD88与转录因子IRF-7诱发干扰素(interferon，IFN)的释放。研究表明，氧化的mtDNA类核苷酸从狼疮中性粒细胞中释放，触发Ⅰ型IFN反应[17]。TLR9的激活导致MyD88受体蛋白对Ⅰ型IFN的强烈诱导，IRF-7与MyD88相互作用，在细胞质中形成复合物，该复合物还涉及IL受体相关激酶-4和受体相关因子6，并为IFN基因的TLR9依赖性激活提供了基础[18]。

2.4其他 mtDNA含有大量未甲基化的CpG DNA序列。用含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸刺激IRF-5基因敲除鼠的树突状细胞，发现TNF-α、IL-6、IL-1的产生显著减少，证实IRF-5参与TLR9-MyD88 信号转导通路，诱导促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-12基因转录[19]。有研究表明，表皮生长因子受体(一种膜结合蛋白酪氨酸激酶)是TLR9信号的关键，表皮生长因子受体本质上与TLR9结合，在配体的刺激下，介导TLR9酪氨酸磷酸化，导致MyD88的招募、信号激酶和转录因子的激活以及基因诱导[2]。这些均很好地阐明了创伤刺激或病原体刺激导致的mtDNA释放激活TLR9诱导的炎症反应的分子机制。

3 mtDNA-TLR9通路介导的炎症反应

3.1mtDNA-TLR9通路与各疾病中的炎症反应 在机体受到DAMPs和外源性病原相关分子模式刺激时，引起线粒体膜电位的转移和ROS的生成，使mtDNA释放到胞质中；胞质mtDNA可以激活TLR9先天免疫反应等，分泌IL-1β、TNF-α和促炎基因表达，也可通过坏死介导的程序性细胞死亡而分泌到细胞外空间；细胞外mtDNA可刺激免疫细胞和上皮细胞，促进组织损伤和全身炎症反应[7]。在未受刺激的细胞中，TLR9位于内质网，在mtDNA的刺激下，TLR9转移到核内体的膜上，在膜上识别配体并激活细胞[20]。有研究表明，阳离子纳米载体诱导的细胞坏死和mtDNA的泄漏可在体内引发严重炎症，炎症由TLR9和MyD88信号通路介导；mtDNA触发中性粒细胞活化，用活化的TLR9拮抗剂寡聚脱氧核苷酸2088预处理中性粒细胞，可以抑制mtDNA诱导的基质金属蛋白酶8释放和p38 MAPK活化[21-22]，说明mtDNA可以通过TLR9-MyD88通路诱导炎症反应。

3.1.1心脑血管疾病 在临床中，慢性心力衰竭、动脉粥样硬化、急性心肌梗死和急性缺血性脑卒中等心血管疾病都会因无菌性炎症引发组织损伤。有研究表明，急性心肌梗死可以引起无菌性炎症，加重组织损伤，导致循环mtDNA水平升高，而mtDNA通过TLR9和NF-κB激活触发先天免疫应答，导致心肌细胞损伤[13]。在动脉粥样硬化疾病中，释放的mtDNA通过与人抗菌肽LL-37形成复合物，对脱氧核糖核酸酶Ⅱ降解具有抗性，并逃脱自噬识别，导致TLR9介导的炎症反应激活，致TLR9的持续活化，引起自身免疫激活和趋化因子或细胞因子的产生，最终加重动脉粥样硬化病变，这些数据为动脉粥样硬化伴发慢性炎症的发生机制提供了新的视角，可能提供了一个有前途的新的治疗靶点[23]。有研究发现，急性缺血性脑卒中患者mtDNA水平增高，而急性缺血性脑卒中患者循环mtDNA水平与分离的单核细胞炎症反应受损有关，该研究根据循环mtDNA水平将急性缺血性脑卒中患者分为感染组和未感染组，在患者血清和mtDNA存在的情况下培养，在内毒素攻击后再现难治性状态，而且TLR9拮抗剂或脱氧核糖核酸酶治疗均可抵消此内毒素感染[24]。因此，mtDNA可以作为卒中相关感染的一种新的生物标志物，成为预防卒中后感染的临床靶点[25]。还有研究表明，与健康对照组相比，慢性心力衰竭患者血浆来源外泌体中的mtDNA增加，mtDNA通过TLR9-NF-κB途径引发炎症反应，而TLR9抑制剂氯喹可以阻断这种作用，这些发现揭示了外泌体诱导炎症的新机制，为慢性心力衰竭等炎症相关疾病的干预和治疗提供了新的视角[15]。急性心肌梗死释放到循环中的mtDNA可能通过TLR9-p38 MAPK通路加重缺血再灌注损伤，从而对心肌产生不利影响[26]。由此推测，mtDNA释放增加激活TLR9，可能是炎症相关疾病的另一个分子靶标，抑制TLR9的激活，可能减轻机体的炎症反应和组织损伤。

3.1.2脓毒症 线粒体功能障碍与严重脓毒症所致的死亡密切相关。脓毒症引发全身炎症反应综合征进而导致多器官损伤。有临床研究表明，危重监护病房的患者mtDNA的循环水平可以预测危重患者的病死率，且这种相关性在TLR9表达升高的患者中尤其明显[27]。脂多糖诱导急性肺损伤和全身炎症会引起mtDNA的释放增加，特异性TLR9抑制剂寡聚脱氧核苷酸2088预处理可显著减轻mtDNA诱导的急性肺损伤和全身炎症反应，说明mtDNA通过调节TLR9识别MyD88/NF-κB通路可能会引发脓毒症诱导的肺损伤[14]。在小鼠模型中，单次mtDNA注射对野生型而非TLR9敲除小鼠的适应性T细胞毒性造成了严重的TLR9依赖性免疫抑制，并引发多种免疫抑制机制(包括脾脏微结构的破坏、交叉呈递树突状细胞的缺失)，说明mtDNA是一种内源性危险相关分子模式，是迄今为止未知的脓毒性免疫麻痹诱导因子，是危重患者早期炎症和随后免疫抑制之间的可能联系，mtDNA不仅可以通过TLR9引起炎症，介导免疫反应，还可能引起免疫抑制，但具体机制还需进一步探索[28]。

3.1.3缺血性疾病 缺血再灌注损伤是一个具有挑战性的临床问题，尤其是涉及胃肠道的损伤。mtDNA在细胞死亡和应激时释放，可引起炎症反应，mtDNA在小鼠肠道缺血再灌注模型中也被释放，与假手术组相比，mtDNA与炎症细胞因子分泌增加和肠道屏障损伤增加有关，说明mtDNA参与缺血再灌注损伤，可能作为肠缺血再灌注的生物标志物[29]。mtDNA也是炎症性肠病激活过程中释放的一种促炎损伤相关分子[30]。mtDNA在缺血性疾病中释放增多，并通过TLR9引发炎症反应，这可能为缺血性疾病治疗提供新的靶点。

3.1.4肝脏疾病 有研究证明，非酒精性脂肪性肝炎患者血浆中含有高水平的mtDNA，具有激活TLR9的能力；大部分血浆mtDNA包含在肝细胞来源的微粒中，从血浆中去除这些微粒后，TLR9的活化能力显著降低；临床上应用的TLR9拮抗剂在预防和治疗作用下阻断非酒精性脂肪性肝炎的发展；这些数据表明，TLR9通路的激活提供了非酒精性脂肪性肝炎关键代谢与炎症表型之间的联系[31]。mtDNA-TLR9介导的炎性通路还可与其他微RNA或长链非编码RNA等其他小分子RNA相互作用，共同调节炎症及免疫反应或其他一些作用。在对乙酰氨基酚引起肝毒性的研究中，肝mtDNA/TLR9/miR-223形成负反馈环，限制小鼠中性粒细胞过度活化和对乙酰氨基酚肝毒性，miR-223的上调在终止急性中性粒细胞反应中起关键作用，证明是乙酰氨基酚肝衰竭的治疗靶点；在没有脱氧核糖核酸酶Ⅱ的情况下，对肝细胞的凋亡刺激诱导TLR9依赖性IFN-β产生和源自mtDNA的受体相互作用蛋白依赖性非凋亡性细胞死亡[32]。在对乙酰氨基酚导致的肝损伤中，趋化因子和线粒体产物释放增多，导致全身炎症反应，而TLR9缺失可阻止炎症和肺损伤的发生[33]。

3.1.5其他疾病 ①糖尿病：人们普遍认为糖尿病前期患者处于与内皮细胞和线粒体功能障碍相关的促炎状态，循环mtDNA水平的升高通过激活内皮中存在的TLR9，在糖尿病前期和老年糖尿病患者中均是早期内皮功能障碍的触发因素[34]。通过抑制mtDNA的释放可以适当改善糖尿病患者的功能状态，提供一定的保护机制。②肾脏疾病：TLR9可能利用内源性mtDNA作为配体促进足细胞凋亡，这是肾小球疾病足细胞损伤的一种新机制[35]。③肺炎：有研究表明，红细胞在正常情况下与mtDNA稳态结合，在发生系统性炎症后mtDNA表达上升，红细胞表达TLR9，并通过TLR9与mtDNA结合，可以清除肺损伤后包含CpG序列的脱细胞的mtDNA，在体内TLR9依赖红细胞介导的mtDNA清除的缺失增加了肺损伤；红细胞介导的mtDNA清除是减轻mtDNA后肺损伤的关键，在疾病状态下(如脓毒症和创伤)，当mtDNA升高时，红细胞在调节肺部炎症中发挥作用，这也可为肺部炎症的治疗提供一些思路[36]。

3.2mtDNA-TLR9通路与癌症 炎症介质和细胞效应因子是肿瘤局部环境的重要组成部分。在某些类型的癌症中，在发生恶性变化前会出现炎症。相反，在其他类型的癌症中，致癌变化会诱导炎症微环境，从而促进肿瘤的发展。潜在的感染和炎症反应与全球15%～20%的癌症死亡有关，缺氧诱导细胞内易位和释放多种DAMPs(如高迁移率族蛋白和mtDNA)，这些DAMPs的分子与其受体相互作用，触发促炎信号级联反应，促进肿瘤进展；研究表明，高迁移率族蛋白结合了缺氧肿瘤细胞胞质中的mtDNA，通过激活TLR9信号通路导致炎症和致瘤信号通路的触发，进而导致小鼠体外肿瘤增殖增加和肿瘤生长加快，mtDNA突变和mtDNA拷贝都与癌症的发展和进展有关；此外，mtDNA可通过TLR9刺激急性创伤和损伤后的炎症反应进入血浆，开发新的癌症治疗策略需要更深入地了解在缺氧环境下癌细胞、免疫细胞、DAMPs和TLRs之间复杂的相互作用[37]。自1973年以来，mtDNA已被认为有致癌作用，如原发性乳腺癌中mtDNA-非编码循环的缺失和插入[38]；另外，异常的mtDNA拷贝数与肺癌有高度的剂量依赖性[39]。在临床样本中检测mtDNA可能是一种有前景的癌症诊断方法，TLR9和mtDNA在肺癌进展和转移中可能发挥一定的作用[40]。在其他的癌症疾病中，mtDNA是否释放增多，是否通过TLR9通路或其他信号通路介导肿瘤的转移还有待于进一步研究。

3.3mtDNA-TLR9通路与病毒 线粒体是免疫系统的中心参与者，mtDNA应激是抗病毒信号的细胞内在触发器，细胞对mtDNA稳态的监测与典型的病毒敏感机制合作，充分参与抗病毒的先天免疫[41]。有研究表明，登革病毒感染诱导mtDNA释放到细胞溶胶中，激活TLR9信号通路，导致IFN产生，登革病毒诱导的mtDNA释放涉及ROS的生成和炎性小体的激活[42]。已有的研究报道均是mtDNA通过线粒体转录因子A使得小鼠mtDNA释放，激活STING(stimulator of interferon genes)-IRF-IFN1信号通路，然后上调IFN激活基因和IFN的表达，从而发挥抗病毒的效应[41]。这是mtDNA在宿主中发挥抗病毒免疫的机制。

4 小 结

mtDNA介导的TLR9炎症通路在越来越多的疾病中发挥重要作用，且还有各种相关的基因参与其中，这可以为疾病治疗提供新的靶点和方向，例如可以通过减少mtDNA的释放，增加mtDNA的清除，以及使用TLR9的拮抗剂来阻断下游的炎症反应。mtDNA通过TLR9激活免疫系统的机制已经为人们所了解，但线粒体释放mtDNA过程中存在的机制，mtDNA识别TLR9受体的具体机制，激活MAPK或更多信号通路的机制以及是否与其他的信号通路有交叉调节等均需进一步探索。未来如何将这种TLR9介导的免疫反应机制运用到临床，治疗各种癌症和炎性疾病还需要进一步研究。