胆囊Cajal样间质细胞与胆囊胆固醇结石形成关系的研究进展

赵健楠，范 莹，吴硕东

(中国医科大学附属盛京医院普外二科，沈阳 110004)

西方成年人群胆囊胆固醇结石(cholesterol gallstone，CG)的发病率为10%～15%[1]。中国人群CG的发病率为4.42%～11%，呈显著上升趋势[2]。CG的病因复杂，主要包括胆汁胆固醇过饱和、胆固醇晶体析出过程加速及胆囊动力障碍等，其中胆囊动力障碍是CG形成的关键因素。研究表明，胆囊运动障碍为胆汁析出和胆固醇结晶提供了空间与时间[3]。至今，对胆囊动力调控的研究大多集中于对胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)敏感性下降、胆囊平滑肌功能减退、CCK受体功能失调以及肝外胆道系统调节功能紊乱等方面。研究发现，消化道Cajal间质细胞(interstitial Cajal cell，ICC)广泛存在于人类及其他哺乳动物消化道中[4-5]。有学者将消化道外器官分布的ICC命名为Cajal样间质细胞(interstitial Cajal-like cell，ICLC)，另有学者为区别于其他间质细胞，也将ICLC称为特络细胞[6]。Lavoie等[7]在豚鼠胆囊中发现了ICLC。Pasternak等[8]在人体胆囊组织中发现了ICLC，并认为其与胆囊产生和传播自发性节律有关。近年来，胆囊ICLC的功能及其与CG形成的关系成为研究热点。现就ICLC与CG形成的关系予以综述，以期为深入研究ICLC功能以及CG的病因提供参考。

1 胆囊ICLC的概述

1.1胆囊ICC/ICLC的发现 ICLC最早由西班牙神经解剖学家Santiago Ramony Cajal在动物消化道中发现，随后有研究在胆囊组织中发现了类似细胞[7-8]。Sun等[9]采用透射电子显微镜成像、反转录-聚合酶链反应及蛋白质印迹法等技术对鼠类胆囊的研究发现，鼠类胆囊中的ICLC呈网状结构，且存在丰富的核周内质网、游离核糖体、线粒体等。Lavoie等[7]利用免疫组织化学、透射电子显微镜及激光共聚焦影像技术在豚鼠胆囊及胆道系统中发现了与胃肠道ICC相似并沿胆囊平滑肌肌束和神经纤维走行的ICLC，研究还发现胆囊肌层的自发性节律性电活动可以被Kit受体酪氨酸激酶抑制剂阻断，表明ICLC在胆囊肌层节律性兴奋的产生和传导中起重要作用。

1.2ICC/ICLC的特异性标志物 对ICC的早期研究常采用甲基蓝、嗜银染色、Champy-Maillet法等方法观察ICC形态和分布，但特异性不高[4]。近年来，ICC基因表达产物c-kit(CD117)成为目前公认的ICC特异性标志物[10]。通过特异性更高的c-kit抗体免疫组织化学染色法对其进行深入研究。

1.3ICC/ICLC与干细胞因子(stem cell factor，SCF)/c-kit信号通路的关系 ICC表达特异性标志物酪氨酸激酶受体c-kit，其配体为SCF。SCF/c-kit信号通路在ICC的发育、分化及表型维持中起重要作用。c-kit发生自发性突变或应用c-kit抗体阻断c-kit的作用，均可引起c-kit活力显著下降，导致ICC无法正常发生及发育。将c-kit中和抗体ACK-Ⅱ注射至新出生小鼠腹腔的研究发现，小鼠肠道正常位相收缩紊乱、慢波活动消失，ICC缺失[11]。此外，ICC培养微环境中足量SCF对ICC的发生、发育及表型维持也至关重要[12]。

目前，主要研究的c-kit/SCF下游通路是SFK(Src家族激酶)途径、磷脂酰肌醇-3-激酶途径、磷脂酶C途径、Ras/Raf-1/MAP途径、Jak-STAT信号转导途径，以上途径在ICC发育、表型维持和功能调控中的作用有待进一步研究。

1.4ICC/ICLC的功能 ICC在消化系统中主要具有起搏平滑肌动力、推进电活动传播以及介导和调节神经递质等功能[13]。研究发现，ICC/ICLC数量减少可能与多种疾病相关，如空肠节段性扩张[14]、胃轻瘫[15]、腹裂相关肠动力障碍[16]等。

1.4.1起搏慢波电位 胃肠道平滑肌有慢波和功能性两种电位，慢波电位又称基本电节律。ICC作为胃肠道的节律起搏点，具有维持周期、自发性去极化及产生慢波电位等特点[17]。有研究显示，移除ICC的平滑肌组织完全或几乎完全失去慢波电位[18]。Balemba等[19]的研究表明，ICLC作为胆囊收缩节律的起搏细胞，参与慢波电位的产生。Fan等[20]发现，ICLC受损的胆囊肌条中，慢波的幅度和频率均明显下降，提示ICLC在胆囊平滑肌节律性兴奋的产生和转导中起重要作用。

1.4.2慢传导波电位 缝隙连接将ICC与神经元及平滑肌细胞广泛连接，构成细胞间信号转导的结构基础。移除小肠平滑肌远端ICC并保留近端ICC的研究显示，近端可观察到慢波电位，而远端慢波电位消失，提示ICC是慢波电位传导的基础，平滑肌细胞间不能传导慢波电位[21]。目前认为，慢波电位通过ICC网络结构在平滑肌细胞间转导，并可调节平滑肌的收缩[22]。

1.4.3介导神经信号转导 ICC/ICLC可能还与神经信号的转导有关。有研究发现，ICC位于自主神经元末端与肌细胞之间，与外部神经元形成类似于经典突触的连接，此结构具有与兴奋性神经元释放的速激肽配位的受体，并对抑制性神经元释放的一氧化氮敏感[23]。Faussone-Pellegrini[24]通过精确测量发现，ICC与平滑肌细胞以及神经细胞之间的连接距离仅为20～30 nm，远远小于通常神经-肌肉细胞的连接间隙(50～100 nm)，提示ICC可能在神经信号转导中起重要作用。

2 胆囊ICLC变化与胆囊动力障碍的关系

2.1ICLC丢失导致胆囊动力障碍 胆囊ICLC数量减少可减弱其在胆囊动力调节机制中的作用，导致胆囊动力障碍。Pasternak等[25]的研究发现，与需手术切除胆囊的非胆囊结石患者相比，胆囊结石患者胆囊肌层ICLC数量显著下降。台剑熊等[26]的研究发现，与非胆囊结石人群相比，胆囊结石患者的胆囊收缩率及胆囊ICLC数量均显著降低。Huang等[27]将30只豚鼠分为高胆固醇饮食的实验组和标准饮食对照组，CG形成过程中，胆囊颈至胆囊底部ICLC数量明显减少，凋亡数量显著上升，表明ICLC数量可能影响胆囊ICLC的功能。彭雅亚和谭宇彦[28]的研究显示，胆囊结石患者平滑肌中ICLC的数量较正常人群明显减少，但目前胆囊结石形成过程中ICLC减少的具体原因尚不确定。有研究认为，胆囊结石形成过程中ICLC减少可能与ICC表型转化有关[29]。目前认为，氧化应激反应、c-kit/SCF通路抑制、胆汁组成成分变化以及炎症反应是CG形成过程中ICLC丢失的主要原因。

2.1.1氧化应激反应导致ICLC丢失 CG形成过程中，胆囊组织的氧化应激反应可能导致ICLC凋亡，数量下降。谭宇彦和嵇振玲[30]通过构建CG模型兔的研究发现，与正常饮食兔相比，CG模型兔胆囊ICLC数量明显减少，且ICLC超微结构改变，网络结构被破坏；进一步将ICLC置于不同胆固醇浓度细胞培养液的研究发现，随着培养液胆固醇浓度的逐渐升高，ICLC抗氧化应激指标超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力逐渐下降，各组ICLC凋亡率明显升高，两者均呈剂量依赖性。在相同胆固醇浓度培养液中加入不同浓度胆固醇清除剂发现，ICLC抗氧化应激指标超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力逐渐升高，且 ICC凋亡率逐渐下降，提示CG形成过程中，胆固醇浓度升高可诱发胆囊组织氧化应激反应，使ICLC不断凋亡，导致胆囊ICLC数量显著减少。但Kaji等[31]对于鼠类空肠ICC的研究显示，由γ干扰素及脂多糖介导的ICC功能障碍在很大程度上由一氧化氮诱导的氧化应激反应所致，一氧化氮通路只降低ICC标志物的表达，并不破坏ICC超微结构，也不导致ICC凋亡。因此，氧化应激反应与胆囊动力障碍的关系仍有待进一步研究。

2.1.2c-kit/SCF通路抑制导致ICLC丢失 高胆固醇浓度可抑制c-kit/SCF通路，影响ICLC发育，使ICLC数量下降。Tan等[32]测定18例行腹腔镜胆囊切除术患者(试验组)和14例行手术治疗胰头肿瘤患者(对照组)术前超声胆囊排空分数的研究发现，试验组胆囊排空分数低于对照组；利用免疫组织化学法观察胆囊标本发现，与对照组相比，试验组患者胆囊ICLC数量明显降低；利用反转录-聚合酶链反应及蛋白质印迹法对胆囊标本的研究发现，试验组患者胆囊信使RNA及蛋白质水平的c-kit/SCF表达均明显下降，表明下调c-kit/SCF信号通路对减少胆囊ICLC数量具有关键作用。Fan等[20]研究发现，高胆固醇饮食动物模型的c-kit及SCF表达水平均明显下降，表明高胆固醇饮食可能通过影响ICLC发育致ICLC受损。Feng等[33]将45只豚鼠等分为标准饮食组、高胆固醇饮食组及茵陈蒿处理组的研究发现，与茵陈蒿处理组相比，高胆固醇饮食组 c-kit 表达及胆囊动力均明显下降，提示茵陈蒿可通过上调c-kit表达保护胆囊动力。另有研究显示，多能干细胞对消化系统受损ICC具有修复作用，并可促进其发生、发育，有助于ICC功能恢复，为细胞学层面胆囊结石及消化道疾病的研究提供新的治疗靶点[34]。

2.1.3胆汁组成成分变化导致ICLC丢失 不同胆汁组成成分可影响胆囊ICLC数量。Pasternak等[35]对30例因CG行腹腔镜胆囊切除术患者(试验组)和25例因其他疾病切除胆囊患者(对照组)的研究发现，试验组胆囊组织ICLC数量明显低于对照组；此外，试验组胆汁甘胆酸和牛磺胆酸水平较对照组明显降低，且ICLC数量与甘胆酸和牛磺胆酸水平成正比，提示胆汁中甘胆酸和牛磺胆酸对ICLC具有保护作用。在成石过程中，胆汁甘胆酸和牛磺胆酸水平降低，过饱和胆汁毒性作用使ICLC数量减少，可见胆汁组成成分对胆囊ICLC数量减少起关键作用。Pasternak等[36]对25例行腹腔镜胆囊切除术CG患者(试验组)和15例行手术治疗胰头肿瘤患者(对照组)的研究发现，试验组胆囊壁ICLC数量明显低于对照组；进一步分析胆汁成分发现，胆汁结晶患者胆固醇饱和指数(表示胆汁成石性)明显升高，试验组患者胆囊甘胆酸和牛磺胆酸的平均水平显著降低，且磷脂分数中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的水平明显升高，两组患者ω-3 PUFA水平比较差异无统计学意义，但试验组ω-6 PUFA水平及ω-6/ω-3 PUFA比率均明显升高，提示胆囊固有肌层ICLC数量与总PUFA、ω-6 PUFA水平以及ω-6/ω-3 PUFA比率可能存在潜在关联。

有研究显示，高摄入量饱和脂肪酸及反式脂肪酸可导致胆囊结石的发生[37-38]，而高摄入量的PUFA及单不饱和脂肪酸则可降低胆囊结石的患病风险[39]。研究表明，胆囊结石患者胆汁ω-6 PUFA的升高是影响胆囊ICLC密度的重要因素，可能是CG发展的病理生理学因素之一。过饱和胆汁的毒性作用可能导致ICLC数量降低，而其他胆汁成分，如ω-3 PUFA、甘胆酸与牛磺胆酸等对ICLC具有保护作用，可能是影响胆囊及肝外胆管动力调节机制的因素。

2.1.4炎症反应致ICLC丢失 胆囊壁的慢性炎症过程可能是ICLC数量减少的重要机制之一。邱虎等[40]对急性胆囊炎模型的研究发现，与正常胆囊相比，急性胆囊炎模型胆囊各部位ICC的数量均减少。研究表明，与高胆固醇饮食组相比，可通过降低熊去氧胆酸处理组肿瘤坏死因子-α水平以及减少炎症细胞浸润保护胆囊ICLC，可见过饱和胆汁及疏水胆汁酸可促进胆囊的炎症作用，肿瘤坏死因子-α的释放可激发肿瘤坏死因子-α/胱天蛋白酶8/胱天蛋白酶3的级联反应，诱导ICLC凋亡[41]。

Portincasa等[42]的研究提示，胆囊动力受损是轻度炎症作用的结果。炎症因子通过影响ICC细胞的微环境改变其表型，Toll样受体4、脂多糖及肿瘤坏死因子-α均参与其中[43-44]。此外，Pasternak等[36]发现，结石患者胆囊及其固有肌层中存在炎症浸润，且炎症浸润与肥大细胞数量显著升高有关。但Pasternak等[25]的研究发现，ICLC细胞减少与炎症级别或肥大细胞数量无关。因此，炎症反应与ICLC数量减少的相关性有待进一步研究确定。

2.2ICLC起搏电位减弱导致胆囊动力障碍 胞内钙离子紊乱及炎症反应可引起ICLC起搏电位减弱，最终导致胆囊动力障碍。胆囊胆固醇结石形成过程中，细胞膜穴样凹陷中过量的胆固醇可能降低细胞膜的流动性，进一步使胞质内钙平衡紊乱[45]。有研究证实，钙离子在单个ICC慢波产生中起重要作用，三磷酸肌醇受体在ICC中大量表达，通过调节钙离子的释放调控起搏电流[46]。大量钙离子是ICLC产生自发电活动的必需物质，ICLC细胞膜与胞质内钙平衡紊乱可导致ICLC膜电位摆动障碍，影响ICLC的起搏功能[47]。此外，炎症反应也可影响ICC的起搏，Kaji等[31]对于鼠类空肠ICC的研究显示，由γ干扰素和脂多糖介导的炎症反应可诱导炎症前体细胞因子的表达，使ICC的起搏活性降低。

2.3ICLC对CCK反应性降低导致胆囊动力障碍 CG成石过程中，胆囊ICLC对CCK的低反应性可导致胆囊动力下降。Xu等[48]对豚鼠胆囊的研究表明，胆囊组织中ICLC表达CCK-A受体；在体外CCK激发实验中，胆囊组织对CCK-A具有明显的收缩反应；而相同条件下，去除ICLC的胆囊组织对CCK-A的收缩反应明显下降，表明ICLC可能介导CCK对胆囊组织的收缩作用。Fan等[20]研究证实，胆囊ICLC在CCK-8引起的胆囊收缩中起关键作用，而结石胆囊中ICLC数量下降可能影响CCK对胆囊组织的收缩作用，导致胆囊运动障碍。另有研究表明，高胆固醇胆汁可使胆囊CCK-A受体表达水平下降，提示高胆固醇胆汁可通过下调ICLC以及平滑肌CCK-A受体的表达降低胆囊平滑肌对CCK的反应性，导致胆囊动力障碍[49]。

3 小 结

目前，对CG成因的研究较广泛，但具体机制尚未完全阐明[50]。CG的形成由多种因素引起，胆囊动力下降是重要因素之一。高胆固醇饮食导致的胆囊动力下降可在很大程度上下调SCF和ICLC表面受体c-kit的水平，导致胆囊ICLC网络受损。但高胆固醇饮食调节SCF及c-kit表达的机制尚不清楚，ICLC数量减少的机制及其具体细胞生物学变化仍不清楚。CG形成过程中ICLC数量减少的具体机制，ICLC的数量与SCF/c-kit下游通路在分子水平的关系，ICLC与神经调节及激素调节等具体的作用机制等均有待进一步研究。对ICLC和CG关系的研究具有十分广阔的学术前景，可为进一步有效预防和治疗CG提供新的切入点。