乳腺癌DNA甲基化临床研究进展

华艳珊，奎 翔，易晓佳，王 燕

(昆明医科大学第二附属医院病理科，昆明 650000)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，是导致全球女性癌症相关死亡的主要原因[1]。以往研究认为，基因突变、缺失等导致DNA序列改变而使癌基因激活、抑癌基因失活是肿瘤发生的主要机制[2]。随着对肿瘤研究的不断深入，研究者发现DNA序列以外的调控机制异常，即表观遗传学变化在肿瘤发生、发展中同样发挥关键作用[3]。乳腺癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段的过程，研究认为是由遗传和表观遗传变异积累的结果[4]。在乳腺癌中，由于基因组事件少于其他癌症，表观遗传修饰被认为在非遗传性乳腺癌中更为重要[5]。因此，研究乳腺癌进展中的表观遗传机制以鉴定临床适用的生物学标志物是合理而有价值的。

DNA甲基化修饰是表观遗传学中常见且重要的一种表现形式，在诸多恶性肿瘤的发生、发展及转归中发挥重要作用。乳腺癌中基因甲基化频率的异常并不少见，涉及的基因种类也极为广泛，其中包括细胞周期调控基因(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A、p14ARF)、DNA修复基因(O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶、人类mutL同源物1基因)、信号转导基因(视黄酸受体β2基因、腺瘤性结肠息肉病基因)及细胞黏附和转移基因(钙黏蛋白1、钙黏蛋白13)等[6]。基因的异常甲基化改变是乳腺癌中普遍存在的分子事件，这种异常的DNA甲基化状态可能成为乳腺癌诊断的潜在生物学标志物，且DNA甲基化修饰过程早于蛋白质翻译，相较于检测癌症相关蛋白表达水平，在乳腺癌早期诊断中可能具有更大的价值。现就DNA甲基化在乳腺癌患者早期诊断、相关临床病理特征、预后及治疗中的临床意义予以综述。

1 表观遗传学与DNA甲基化

表观遗传学变化是指并不涉及遗传序列变化的特征性遗传改变，涉及的分子机制主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰(乙酰化、磷酸化、甲基化等)或蛋白质构象改变、染色质重塑、X染色体失活以及非编码RNA[7]。其中DNA甲基化是表观遗传改变的主要形式，DNA甲基化是指核酸序列中胞嘧啶在DNA甲基转移酶的作用下，被修饰为5-甲基胞嘧啶的过程，其甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸。DNA甲基化发生于CpG序列，C、G两种核苷酸高度聚集形成CpG岛，主要位于基因的启动子区和第一个外显子区域。CpG岛的高甲基化促进染色质形成致密结构，不利于基因的表达。在正常组织中，70%～90%的散在CpG是被甲基化修饰的，而CpG岛则是非甲基化的[8]。甲基化修饰是基因表达调控的一种重要机制，基因组DNA甲基化的异常改变可以通过影响染色质结构、上调或下调基因表达，导致基因功能改变和细胞恶性转化，最终形成肿瘤。

2 DNA甲基化检测与乳腺癌早期诊断

流行病学研究显示，早期诊断比治疗更有利于改善乳腺癌患者的生存率[9]，通过乳腺钼靶检查早期诊断乳腺癌能够有效降低30%的病死率[10]。然而，尽管乳腺钼靶及其他影像学检查手段诊断乳腺癌有较高的特异性和敏感性，并已成为一种较为有效的乳腺癌筛查和诊断方式，但射线辐射、主观判断以及对于检测年轻女性乳腺增生缺乏敏感度等因素导致这种方法也存在一定的局限性[11]。乳腺钼靶检查的假阳性结果可能带来过度诊断和过度治疗，导致肿瘤细胞更快地扩散[12]。因此，有必要开发更加准确、高效的分子标志物来实现更高的诊断效率。

研究证实[13]有大量的基因呈现出癌症特异性的甲基化改变，且在乳腺癌患者中有较高的发生比例，同时通过DNA甲基化检测诊断乳腺癌的相关系列研究均显示出较高的诊断特异性和敏感性，是有望成为早期诊断乳腺癌的重要分子标志物。人类Runt相关转录因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)基因是一个抑癌基因，在乳腺癌等多种肿瘤中被抑制失活，该基因的高甲基化是使其失活的重要机制之一[14]。Lu等[15]对RUNX3基因高甲基化在乳腺癌中的临床病理学意义进行了一项Meta分析，对747例乳腺癌病例的数据资料分析显示，RUNX3高甲基化与乳腺导管原位癌和导管浸润癌的发生风险显著相关，与雌激素受体阴性乳腺癌病例相比，RUNX3甲基化率在乳腺癌雌激素受体阳性病例中显著升高，并且RUNX3基因信使RNA高表达与无瘤生存期延长显著相关，提示RUNX3基因高甲基化与乳腺癌临床病理分型及生存预后存在重要联系，作为乳腺癌早期诊断分子标志物有较大的应用前景。另有研究显示，人端粒酶反转录酶基因[16]、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)[17]和腺瘤性结肠息肉病基因[17-18]等基因在乳腺癌患者中同样发生了较高比例的甲基化改变，可以作为乳腺癌早期诊断的候选标志分子。

值得注意的是，个别基因甲基化虽然表现出良好的乳腺癌特异性，但单独用于诊断乳腺癌往往敏感性较差，因此需要联合检测多个基因甲基化位点改变，构建详细的甲基化联合图谱，以此作为早期诊断乳腺癌的诊断标记。Brooks等[6]发现，联合Ras相关区域家族1A、谷胱甘肽S-转移酶P1、视黄酸受体β2基因和腺瘤性结肠息肉病基因甲基化检测可以显著改善乳腺癌的诊断效率。Shan等[19]进行的一系列研究同样证实了这一点，他们通过采集乳腺癌、乳腺良性结节和健康人群3组血清样本，联合检测人分层蛋白、p16、人类mutL同源物1基因、同源框D13基因、原钙黏蛋白B亚族7和Ras相关区域家族1A基因启动子区域的甲基化改变，结果显示，与良性结节组、健康人群组相比，乳腺癌组诊断乳腺癌的灵敏度分别为82.4%、79.6%，特异度分别为78.1%、72.4%，相较检测单个基因可明显提高诊断的敏感性和特异性，提示多个基因甲基化联合检测更具有临床应用潜力，这可能是未来甲基化检测用于癌症诊断的发展方向。

3 DNA甲基化与乳腺癌临床病理特征

研究显示，DNA甲基化与乳腺癌临床病理特征之间确实存在显著关联[20]。An等[21]对乳腺癌患者O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因启动子甲基化的研究发现，O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶高甲基化与雌激素受体阴性表达、绝经及临床病理学Ⅲ级分期相关。He等[18]研究发现，腺瘤性结肠息肉病基因启动子甲基化与癌症分期、淋巴结转移和雌激素受体表达情况均相关(在分期较高和淋巴结转移时升高，雌激素受体阳性表达时降低)。Callahan等[22]评估了720例乳腺癌病例的肿瘤样本中9种基因分泌球蛋白家族3A成员1、谷胱甘肽S-转移酶P1、视黄酸受体β2基因、脾相关酪氨酸激酶、脆性组氨酸三联体基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A、细胞周期蛋白D2、BRCA1和人分层蛋白甲基化与肿瘤临床病理特征和生存的关系，发现雌激素受体和孕激素受体阳性与分泌球蛋白家族3A成员1高甲基化相关；在绝经前妇女中，与0期患者相比，侵袭性癌患者更可能具有视黄酸受体β2基因高甲基化，脆性组氨酸三联体基因则具有更低甲基化；在绝经后妇女中，脾相关酪氨酸激酶的甲基化与肿瘤大小增加和更高的核级相关；BRCA1和分泌球蛋白家族3A成员1高甲基化与乳腺癌死亡风险降低相关，细胞周期蛋白D2甲基化则与乳腺癌死亡风险增加有关。与肿瘤临床病理特征相关的甲基化差异体现了DNA甲基化与乳腺癌临床病理特征的关联性，检测这些基因甲基化可能会对预防和治疗产生重要影响。

DNA异常甲基化在乳腺癌发生、发展过程中能够沉默抑癌基因表达，同时导致原癌基因激活，并可通过下游信号通路参与不同类型乳腺癌临床病理特征的形成，特别是激素受体表达状态。这可能部分解释特定基因甲基化与乳腺癌临床病理特征存在显著相关性的原因，但产生这一关联性的具体机制还需更进一步研究。目前研究结果也只反映出特定基因与一部分临床病理特征相关，且限于多数实验研究样本量较小，DNA甲基化检测方法各异等因素，所得出的研究结果还存在一定争议，尚无一致性结论。

4 DNA甲基化检测与乳腺癌预后评估

在常规临床实践中，部分临床病理特征被用于评估乳腺癌患者可能预后，如肿瘤大小、组织学分级、肿瘤分期、淋巴结转移等[23]。其次，乳腺癌不同分子亚型也提示不同的预后情况。研究表明，与其他分子亚型相比，三阴性乳腺癌往往肿瘤级别较高，有更高风险发生淋巴结转移或远处转移，并且相对缺乏有效的治疗方法，导致无瘤生存和总体存活率较低[24]。对于肿瘤患者而言，一经确诊，对其进行尽可能准确的生存预后评估，直接影响患者的后续治疗及治疗依从性。因而，探寻新的预后评价指标也是肿瘤研究的重点内容，而DNA甲基化在乳腺癌预后评估中同样也能够发挥一定作用。

研究显示，在乳腺肿瘤或乳腺癌细胞系中已有超过100个基因被鉴定出现异常甲基化[25]，且DNA甲基化与乳腺癌临床病理特征存在显著相关性，而乳腺癌临床病理特征又与患者预后密切相关，提示DNA甲基化可能成为评估乳腺癌患者预后的独立预测因子，有望成为辅助现有预测指标的有力工具。

Sheng等[26]进行的一项Meta分析评估了乳腺癌中谷胱甘肽S-转移酶P1、p16、雌激素受体1和垂体同源盒2启动子甲基化对患者预后的影响，在大样本患者群体中，谷胱甘肽S-转移酶P1在总生存率中呈现出更差的预后趋势，垂体同源盒2启动子甲基化与总生存率预后差和无转移生存期短的不良预后显著相关，雌激素受体11启动子甲基化与总生存率预后较差相关，异常甲基化的雌激素受体11、垂体同源盒2和谷胱甘肽S-转移酶P1的临床应用可能是乳腺癌预后的一个有前途的检测指标。Minatani等[27]研究了172例原发性乳腺癌组织中半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase 1，CDO1)基因的启动子甲基化状态，在原发性乳腺癌患者中显示出CDO1基因启动子甲基化与不良预后的强相关性，尤其是三阴性乳腺癌，CDO1基因甲基化状态被认为是原发性乳腺癌的理想预后指标。Dietrich等[28]证明原发性乳腺癌中CDO1基因的启动子甲基化过度，并可能是原发性乳腺癌患者伴有淋巴结转移的远处转移预测因子。Jeschke等[29]证明CDO1基因的启动子DNA甲基化与肿瘤进展显著相关，且在用蒽环类药物治疗的原发性乳腺癌患者中发现预后相关性。因此，基因的异常启动子甲基化可提供更独立的预后信息作为乳腺癌治疗和管理中的预后指标。

5 DNA甲基化与乳腺癌治疗新靶标

新的生物学标志物发现对乳腺癌的诊断创新和个性化医疗至关重要[30]。由于DNA甲基化改变在乳腺癌发生机制中发挥重要作用，以去甲基化恢复特定基因活性是肿瘤预防和治疗的一种有效手段，目前研究最多的是DNA甲基转移酶抑制剂。第1个表型修饰药物为5-氮杂胞苷及其类似物5-氮杂-2′-脱氧胞苷，它通过抑制DNA甲基转移酶活性以逆转异常的DNA甲基化，2006年已被美国食品药品管理局批准[31]用于白血病前骨髓增生异常综合征的治疗。目前正在进行5-氟-2′-脱氧胞苷的临床试验用于治疗乳腺癌和其他实体瘤[32]。但临床应用该类药物也存在不可忽视的不良反应，一方面，DNA甲基转移酶抑制剂特异性不强，不能针对某一特定抑癌基因进行靶向治疗，在去除异常甲基化的同时也可能干扰正常基因甲基化；另一方面，研究显示高剂量的5-氮杂-2′-脱氧胞苷可能诱发肿瘤的转移播散，因此该类药物在临床上的应用受到很大限制，研究开发靶向去甲基化药物可能显著降低不良反应，达到更好的治疗效果。

DNA甲基化除能为乳腺癌患者开发新的治疗策略外，某些特定基因的甲基化状态还可能影响治疗决策。BRCA1基因低表达(BRCAness)乳腺癌代表以BRCA1基因表达减少为特征的一组散发性肿瘤。由于BRCA1参与双链断裂修复，功能失调的BRCA途径可能使肿瘤对DNA损伤药物(如顺铂)和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制剂疗法敏感[33]。因此，准确鉴定BRCAness肿瘤有助于临床医师进行治疗决策。Branham等[34]研究发现，BRCAness肿瘤的强预测因子是人类mutL同源物1基因和成对框5基因的甲基化以及细胞周期蛋白D2和DNA结合抑制因子4的非甲基化，检测这些基因的甲基化状态对于诊断BRCAness肿瘤具有一定的指示作用。该研究表明，基因甲基化状态的改变也能作为鉴定BRCAness乳腺癌的分子标志，而不再仅仅关注BRCA的突变状态。

临床上针对曲妥珠单抗的抗性发展导致疾病复发仍是针对人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌治疗的主要障碍。Palomeras等[35]发现，耐曲妥珠单抗SKTR细胞和曲妥珠单抗敏感的SKBR3细胞中甲基化状态不同，在SKTR细胞中4种高甲基化基因包括转化生长因子β1、Bcl-6、p53调控DNA复制抑制因子和组织蛋白酶Z通过聚合酶链反应分析显示表达下调，用脱甲基剂处理SKTR细胞可重新获得所有4种基因的表达，且这些基因恢复的表达水平与SKBR3细胞的表达水平一致。因此，高甲基化基因转化生长因子β2、Bcl-6、p53调控DNA复制抑制因子和组织蛋白酶Z在人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌患者中可能作为曲妥珠单抗耐药的预测性分子指标。DNA甲基化与药物耐药的研究有望发现更多类似的耐药预测性生物标签，脱甲基化处理可能一定程度恢复乳腺癌患者对化疗药物的敏感性。

6 结 语

DNA甲基化与乳腺癌临床病理特征、预后显著相关，在乳腺肿瘤发展中选择特定的DNA甲基化标记可能会促进乳腺癌早期诊断和临床管理新方法的发展。但要鉴定可靠的甲基化生物标签仍需更多大样本的实验研究提供支持，同时需要更加精确的甲基化检测技术保证实验结果的准确性和可靠性。目前，已有多个基因展现出很好的实验效果，并有望应用于乳腺癌临床诊疗。同时，甲基化检测技术方法正在不断更新和进步。总之，乳腺癌DNA甲基化的临床研究已展现出较好的应用前景。