六种国产粪便隐血检测试剂的诊断性能评价*

李文东，白海燕，李淑莲，林惠玲，谌泰春，徐士兰，张惠林

(1.厦门市湖里区妇幼保健院，福建厦门 361006；2.厦门大学附属中山医院，福建厦门 361004)

粪便隐血是指消化道出血，红细胞已被消化破坏，肉眼和显微镜下均不能证实的出血[1]。常见粪便隐血检测方法根据检测原理不同有化学法和免疫法两种定性检测法，各有其优点和不足[2]。化学法(如匹拉米洞法、邻甲苯胺法、还原酚酞法等)易受食物、药物等干扰因素的影响；免疫法(如酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等)敏感度高、特异性好，不受食物因素的影响，无需禁食[3]，但可能因血红蛋白变性而出现假阴性结果[4]。目前国内外尚无标准化的粪便隐血试验的性能评估方法，面对性能指标信息有限、品种繁多和应用广泛的粪便隐血试剂，临床医生与检验人员充满困惑与迷茫。本研究综合评价六种临床常用国产商品化粪便隐血试剂的检测性能，包括最低检测限、分析特异性(包括交叉反应性和干扰物质)和高浓度血红蛋白检测能力等，为探讨粪便隐血试剂的性能评估方法提供借鉴，并为临床实验室选择合适的粪便隐血试剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 临床粪便样本：120例新鲜粪便样本来自厦门大学附属中山医院消化内科就诊患者，包括消化道出血53例，男性33例，女性20例，中位年龄56.60±14.62岁；消化道肿瘤67例，男性46例，女性21例，中位年龄59.76±11.45岁。另有80例新鲜粪便标本来自健康体检者，其中男性54例，女性26例，中位年龄57.76±13.40岁。采用清洁干燥不吸水带盖容器采集新鲜粪便标本，立即送检，于收集后1 h内完成检测。所有样本的使用均经医院伦理委员会批准，并获得患者本人的知情同意，签署知情同意书。

1.1.2 最低检测限样本：采用无菌蒸馏水将40 mg/ml的人血红蛋白(批号F16062401，厦门市波生生物技术有限公司提供)稀释至25，50，75，100，150，200，400和1 000 ng/ml等8个浓度。所有样本均在使用前临时配制，确保现配现用。

1.1.3 高值血红蛋白样本：用无菌蒸馏水将40 mg/ml的人血红蛋白(批号F16062401，厦门市波生生物技术有限公司提供)稀释至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 mg/ml和40 mg/ml共12个浓度。所有样本均在使用前临时配制，确保现配现用。

1.1.4 特异性试验样本：在200 ng/ml的血红蛋白溶液中加入不同量的维生素C，使最后的维生素C浓度分别为0.01，0.05，0.1和0.3 mg/ml。所有样本均在使用前临时配制，确保现配现用。将牛、狗、鸡、猪、羊以及兔的血红蛋白分别配制成浓度为0.5 mg/ml的样本，将辣根过氧化物酶(HRP)配制成2 mg/ml的样本[5]。

1.2 试剂 六个国产粪便隐血检测试剂的厂家包括：厦门市波生生物技术有限公司(胶体金法，批号为H17062401，简称波生)、艾博生物医药(杭州)有限公司(胶体金法，批号为2017030350，简称艾博)、英科新创(厦门)科技有限公司(胶体金法，批号为20170610，简称新创)、北京万华普曼生物工程有限公司(金试纸条，批号为17070023，简称万华)、广州万孚生物技术股份有限公司(免疫层析法，批号为W03070704S，简称万孚)和珠海贝索生物技术有限公司(匹拉米洞半定量检测法，批号为217041，简称贝索)。以上各种粪便隐血试剂均按照各试剂说明书妥善保存，严格按产品说明书操作并判断结果。

1.3 方法

1.3.1 室内质量控制：每批检测开始前检测自制质控品，质控品结果为阳性才进行后续检测。

1.3.2 样本检测：所有样本(包括临床样本以及上述所有配制样本)，均采用六种国产粪便隐血检测试剂分别检测，每个样本重复检测3次，操作方法严格按试剂说明书进行，记录检测结果。

1.4 统计学分析 六种国产粪便隐血试剂的就诊患者和健康体检人员的阳性率比较采用χ2检验，运用SPSS Statistics 20进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六种国产粪便隐血检测试剂最低检测限比较 见表1。本研究采用六种国产粪便隐血试剂分别检测不同浓度的人血红蛋白溶液，化学法的检测试剂(贝索)的最低检测限为25 ng/ml，其它五种免疫法检测试剂(艾博、波生、新创、万华和万孚)的检测限分别为50，100，150，200和200 ng/ml。

表1 六种国产粪便隐血试剂最低检测限

注：“-”为阴性，“+”为阳性。

2.2 六种国产粪便隐血检测试剂对高值血红蛋白检测高限比较 见表2。

表2六种国产粪便隐血试剂高浓度血红蛋白检测结果

血红蛋白浓度(mg/ml)试剂厂家及检测结果贝索波生艾博新创万华万孚123456789102040++++++++++++++++++++++--++++++++++--+++++++-----+++---------+++---------

注：“-”为阴性，“+”为阳性。

贝索试剂(化学法)检测40 mg/ml人血红蛋白呈阳性，波生和艾博两种便隐血试剂检测人血红蛋白高值为10 mg/ml，新创试剂可检测人血红蛋白高值为7 mg/ml，万华和万孚两种试剂的检测高值为3 mg/ml。除贝索试剂外，当血红蛋白浓度高于各试剂检测高值时，检测结果呈阴性。

2.3 六种国产粪便隐血试剂检测特异性分析 本研究也针对粪便隐血试剂的检测特异性进行评估，分别测试动物血、辣根过氧化物酶和维生素C这三种干扰物质对粪便隐血试剂检测结果的影响。待检样本中加入不同动物来源的血红蛋白和辣根过氧化物酶干扰物质后，除贝索检测六种500 μg/ml的动物血红蛋白均呈阳性，万孚和新创两种粪便隐血试剂检测500 μg/ml兔血红蛋白样本时出现阳性结果外，其余均不与牛、狗、鸡、猪、羊和兔的血红蛋白以及HRP发生交叉反应，见表3。

表3干扰因素下六种国产粪便隐血试剂的检测结果

标本(μg/ml)检测试剂贝索万孚新创艾博波生万华牛血(500)狗血(500)鸡血(500)猪血(500)羊血(500)兔血(500)HRP(2000)++++++------+------+----------------------

注：“-”为阴性，“+”为阳性。

维生素C是粪便隐血试验假阴性结果的影响因素，在我们的实验中，200 ng/ml血红蛋白样本中维生素C含量在0.01～0.3 mg/ml范围，波生、万孚、贝索和艾博四种试剂检测结果不变；而新创和万华两种粪便隐血试剂在维生素C含量高于0.1 mg/ml时，检测结果改变，结果由阳性变为阴性。提示维生素C含量高于0.1 mg/ml时将导致新创和万华检测试剂出现假阴性结果，见表4。

表4维生素C对六种国产粪便隐血试剂的影响

试剂厂家维生素C浓度(mg/ml)及检测结果00.010.050.10.3波生万孚贝索艾博新创万华++++++++++++++++++++++--++++--

注：“-”为阴性，“+”为阳性。

2.4 六种国产粪便隐血试剂临床标本检测结果 采用六种国产粪便隐血试剂分别检测120例消化内科就诊患者(试验组)和80例健康体检人员(对照组)新鲜粪便标本，检测结果见表5。120例消化内科患者的六种试剂阳性率在23.3%～60.0%区间，依次为贝索60.0%，艾博46.7%，波生42.5%，新创40.0%，万华33.3%和万孚23.3%。统计学分析显示试验组六种方法的检测阳性率之间差异有统计学意义(P<0.05)；80例健康体检者的检测阳性率在1.3%～2.5%之间，统计学分析显示对照组六种方法的检测阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 六种国产粪便隐血试剂临床标本检测结果比较

3 讨论

粪便隐血试验对消化道出血的诊断有重要价值，现在常作为消化道恶性肿瘤早期诊断的一个筛选指标[6～8]。与确诊消化道出血的金标准消化道内窥镜检查相比，粪便隐血试验具有非侵入性、标本留取方便、检测快速、成本低廉等优势而容易被患者接受[9，10]。目前市面上用于粪便隐血检测的方法主要是化学法和免疫法，无论是化学法或免疫法检测试剂，在临床应用前都需要对厂家声明的性能参数进行验证，至少应包括：检出限、符合率，如为定量方法应验证精密度(包括重复性和中间精密度)[11]。本项目对六种国产粪便隐血试剂，包括五种免疫法试剂和一种化学法检测试剂进行了检出限评价。化学法试剂(贝索)的最低检测限为25 ng/ml，五种免疫法试剂(艾博、波生、新创、万华和万孚)的检测限分别为50，100，150，200和200 ng/ml，六种试剂的最低检测限均符合各厂家的最低检测限声明。目前的隐血检测方法敏感度高，胃肠道少量出血可检出阳性结果，有研究发现牙龈出血也可能致粪便隐血阳性[2，12]，因此对于无症状患者阳性结果解释需慎重，必要时进行随访复查。

化学法粪便隐血试剂是基于血红蛋白具有过氧化物酶活性的测定方法，以匹拉米洞方法为代表，利用匹拉米洞为呈色指示剂，在酸及过氧化氢溶液作用下，与血红蛋白作用，产生紫蓝而后呈现紫红的颜色。此法特异性差，无法区分血红蛋白来源于消化道出血或来源于食物，甚至有些药物的使用也会影响检测结果。而免疫法粪便隐血试剂，主要是检测人体血红蛋白抗原，具有较强的特异性和灵敏性，一般不受食物和药物等因素的影响，基于这种优势，免疫法采用抗人血红蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，特异地与粪便中人血红蛋白结合，利用胶体金等标记进行显色测定，已广泛应用于临床。但也有不足之处，可能因血红蛋白变性或降解而产生假阴性结果[4，13]。本研究分别研究动物血(牛、狗、鸡、猪、羊和兔)、辣根过氧化物酶和维生素C三类常见的干扰物质对粪便隐血试剂检测人血红蛋白的影响。贝索试剂(化学法)在检测不同动物(牛、狗、鸡、猪、羊和兔)来源的血红蛋白时均产生假阳性结果。万孚和新创两种粪便隐血试剂检测500 μg/ml的兔血红蛋白样本时出现阳性结果，但对HRP检测无反应，波生、万华和艾博三种粪便隐血试剂对500 μg/ml的牛、狗、鸡、猪、羊和兔的血红蛋白以及HRP检测无反应。对于抗维生素C的干扰能力，波生、万孚、贝索、艾博的试剂优于万华和新创。

粪便隐血试验是临床粪便常规检测中的一个重要的检测项目，广泛应用于消化道、胃肠道病变等内科疾病的诊断中，对消化道出血的诊断具有极其重要的价值[14]。如何选择高性能的粪便隐血试验，是临床和检验人员共同关注的问题。本文平行对比分析六种检测方法在临床中的应用，结果显示，六种方法的检测阳性率在23.3%～60.0%，其差异较大(P<0.05)。即使同为免疫法试剂，其检测阳性率也有差异(23.3%～46.7%)。诊断试剂所选用的抗体、试剂的稀释液和试剂制作工艺不同，都会影响试剂的性能[3]。即使是同一个基因工程抗原，用在不同的公司产品中，其特异性也可能不同，这是目前基因工程抗原用于实验诊断的最大问题。因此，为了提高诊断试剂检测的质量，开展由卫生主管部门主导的实验室室间质量控制，提升解决不同产品检测灵敏性差异较大的短板，是非常重要的[15]。建议选用某种诊断试剂产品前应该做好临床评估，建立可溯源性的诊断试剂定量检测体系。

本研究存在一定的局限性，首先是我们仅对六种粪便隐血试剂一个批次的产品进行性能评估，不能反映不同批次的产品性能。此外，本研究纳入的临床粪便样本，并未全部进行消化道出血的金标准内窥镜检查，因此无法评估其诊断效能，包括检测敏感度和特异度。而且，本研究也仅对同一批样本的阳性率进行了比较，未对不符合的样本进行追踪。目前临床检验中心尚未开展粪便隐血的实验室室间质评，市面上没有相关的粪便隐血的标准品用于质量控制，实验室多采用自制的质控品用于日常工作的质量控制[2]，本研究也仅采用人血红蛋白来检测试剂的最低检测限和最高值血红蛋白检测能力，有条件时增加与标准物质比较的结果，建立主管部门牵头的完善质量评估体系，将是解决当前粪便隐血试剂质量良莠不齐的当务之急。