磺胺二甲嘧啶与镉单一和复合污染对生菜生长的影响

卢毅欣，杨 琛*，李华峰，刘传平，党 志,

1. 华南理工大学环境与能源学院，广东 广州 510006；2. 广东省生态环境技术研究所，广东 广州 510650；3. 工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室，广东 广州 510006

抗生素作为一种高效的抗菌药剂被广泛用于动物和人类的治疗，同时也用作饲料添加剂被广泛应用于畜牧业中；而磺胺类药物作为畜牧业使用量最大的兽用抗菌药之一，其在饲料中的使用剂量高达 100－200 mg·kg-1（隋倩雯等，2016）。抗生素药物除了少部分被动物体吸收外，其余均被排出体外进入环境造成残留污染，并通过食物链危害人体健康。在地表水体（汪涛等，2016）、农田土壤（Li et al.，2011）以及农作物包括玉米（Zea mays L.）、生菜（Lachica sativa L.）、马铃薯（Solanum tuberosum L.）（Dolliver et al.，2007）和多种常见蔬菜（李学德等，2010）中均能监测到较高浓度的磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SM2）。同时由于大气沉降、污水灌溉、农用物资不合理施用等，农田土壤的重金属不断积累，其中重金属镉（Cadmium，Cd）不仅能抑制植物生长，高浓度镉甚至可致植物死亡，且易被蔬菜富集并通过食物链危害人体健康（杨望等，2013；孙丽娟等，2018）。2014年中国环保部和国土资源部共同发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国耕地土壤Cd点位超标率为7.0%，在污染物中排位第一。据张怀志等（2017）报道，农田土壤重金属含量达0.07－4.83 mg·kg-1（张怀志等，2017；Zhai et al.，2008），镉已成为农田土壤中主要的污染重金属元素。

畜禽粪便的肥料化使用导致重金属和抗生素复合污染在农田中普遍存在。有研究表明，两种污染物共存时，可能会产生协同、拮抗或加和等作用（刘爱菊等，2013；梁延鹏等，2016），而有机物和重金属还会发生络合反应。已有研究发现有机物如菲（Phenanthrene，Phe）、乙二胺四乙酸（Elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等与Cd共存时，其络合物可能具更高毒性，影响作物生长（Maslin et al.，2000），还有可能促进植物吸收重金属（Ptak et al.，2015），造成食品安全隐患。近年来，珠三角蔬菜生产在农业生产的比重不断增加，蔬菜生产地不断扩大（崔晓峰等，2012），菜地SM2和Cd复合污染应受到重视。菜地环境中共存SM2和Cd时，两者的交互作用可能会影响蔬菜生长，更有可能影响蔬菜富集污染物程度，造成食品安全隐患。目前的研究多侧重于单一的SM2或 Cd对蔬菜的影响，而有关两者复合污染对蔬菜生长及污染物富集的影响研究鲜有报道。因此，研究SM2和Cd复合污染下蔬菜生长和污染物富集，对于评估复合污染的生态环境风险以及保障食品安全十分重要。

生菜，属菊科莴苣属，栽培广泛。本试验以生菜为材料，考察不同质量浓度配比SM2与Cd复合污染条件下，植物种子发芽率、生物量、根长，以及植物对污染物的富集情况，以期为科学认识抗生素和重金属共存对植物的影响，为蔬菜安全生产提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 生菜

供试生菜种子购自北京阳台自留地科技有限公司，中国农业科学院选育，发芽率95%左右。

1.1.2 化学试剂

SM2，化学式为C12H14N4O2S，纯度＞99%，购于美国Sigma公司，-20 ℃保存。CdCl2（Cadmium chloride），优级纯纯度＞99.9%，购于比利时 Acros公司。乙腈和甲醇均为色谱纯，购自上海安谱科学仪器有限公司；KNO3，NaNO3，MgCl2，KH2PO4及其他试剂均为分析纯，购自阿拉丁试剂有限公司；实验用水为超纯水，由 Milli-Q超纯水仪制备（Merck Millipore Advantage A10）。

1.1.3 水培营养液

生菜水培体系选用Hoagland营养液配方：0.08 mg·L-1CuSO4·5H2O、1180 mg·L-1Ca(NO3)2·4H2O、0.09 mg·L-1H2MOO4、490 mg·L-1MgSO4·7H2O、0.22 mg·L-1ZnSO4·7H2O、510 mg·L-1KNO3、0.02 mg·L-1Fe-citrate、1.81 mg·L-1MnCl2·4H2O、2.86 mg·L-1H3BO3、140 mg·L-1KH2PO4，调节 pH 为 5.5－6.5。

1.2 试验设计

1.2.1 种子发芽毒性试验

选取饱满度一致的种子，浸泡于0.1%的H2O2溶液中表面消毒 10 min，随后用去离子水冲洗 3遍。试验采用随机区组设计，参考《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB15618－2018）中农用地环境水田 Cd污染风险筛选值（0.3－0.8 mg·kg-1）、珠三角农田磺胺类抗生素检出质量分数（33.3－321.4 μg·kg-1）、广州典型有机蔬菜基地土壤 SM2检出质量分数（0.04－214 μg·kg-1）以及参考其他相关文献的实验设计方案（Li et al.，2011；成玉婷等，2017；金彩霞等，2010；Lu et al.，2014），本试验SM2质量浓度梯度设置为 0、0.5、2、10 mg·L-1，Cd 设置为 0、1、5 mg·L-1。在垫有3层滤纸的直径为9 cm的培养皿中加入15 mL配制好的处理液后，在每个处理培养皿中均匀放置20粒种子，每处理设置3个重复，对照组中添加等体积无菌水，20 ℃恒温遮光培养。采用称重法，每日加水保持恒重以补充所蒸发的水分，待对照组种子根长约20 mm时停止试验，统计各处理发芽率。

1.2.2 生菜水培试验

选取与 1.2.1中对照处理相同方法培育的长势均一的生菜种子，均匀放入盛有蛭石、泥炭的穴盘中培养至3叶1心幼苗，选取长势良好均一的幼苗洗去根部残留的基质，移栽入盛有Hoagland营养液的水培箱（规格统一，3 L）中，待生长到5片展叶苗时，移栽入盛有处理液和Hoagland营养液的3 L水培箱中，生物量、根长、污染物积累试验设计与1.2.1同，对照组中添加等体积Hoagland营养液，并调节pH至5.6－6.5。每处理4株苗，设置3个重复。水培箱中定时通氧，每隔5 d补充适量纯净水，保持恒体积，并调节 pH，白天温度保持在(25±2) ℃，晚上温度保持在(18±2) ℃，培养 30 d后收获。

1.3 测试指标与方法

1.3.1 生菜生长指标测定

生菜种子萌发实验结束后统计发芽率；生菜水培试验结束后用去离子水冲洗3遍，用滤纸上吸干表面水分，测量各处理苗根长，统计根长抑制率RI（式 1）；水培试验中，生菜收获后用剪刀将根部和地上部分开，用滤纸吸去表面水分后称取植物地上部和根部鲜重，测量各处理样品根长（以主根长为准），统计鲜重、根长抑制率（式1）。

式中，RI为根长抑制率；L0为对照组平均根长，cm；Li为各实验组平均根长，cm。

1.3.2 生菜污染物积累指标

生菜污染物积累指标主要测定植物根部及地上部Cd质量分数，植物根部及地上部SM2质量分数。植物收获后用去离子水冲洗3遍，用滤纸吸干表面水分，用剪刀分开根部和地上部，冷冻干燥后用粉碎机粉碎，密封保存待测。

1.3.3 污染物提取与检测

用天平称取生菜根部和地上部粉末各(500.0±0.5) mg，采用湿式消解法进行消解，待消解完全后将消解液移入容量瓶定容至50 mL，用火焰原子吸收分光光度计（型号：Z-2300，日本日立公司）测定Cd质量分数（Zhao et al.，2004）。

用天平称取植物根部和地上部粉末各(500.0±0.5) mg，加入乙腈涡旋振荡提取30 min，离心后提取上清液，残渣再用10 mL乙腈分3次洗涤，合并上清液；SPE小柱为CNWBOND Alumian-B碱性氧化铝，SM2检测方法操作如下：SPE小柱先用乙腈活化；准确吸取4 mL待净化液以每秒1滴的流速过柱，低真空抽干小柱；2 mL乙腈：0.05%甲酸纯净水（V1/V2=60∶40）洗脱2次后，定容至10 mL高效液相色谱（HPLC，型号：安捷伦 1260）测定（Kummerer，2009）。实验仪器参数：色谱柱为Luna，C18(2)型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为（0.05% V/V）甲酸溶液∶乙腈=40∶60；流速为0.5 mL·min-1；进样量为100 µL；检测波长为264 nm；出峰时间为3 min。

1.3.4 数据处理

运用Excel 2010计算各处理组的平均值和标准偏差；运用OriginPro 8绘制数据图；运用SPSS 22.0软件中单因素方差分析方法进行正态性和齐性检验，Duncan（D）多重比较进行差异性显著分析（P＜0.05），双因素方差分析进行SM2和Cd交互作用的检验。

2 结果与分析

2.1 植物生长的影响

2.1.1 发芽率

试验结果（图1）表明，Cd和SM2单一处理对生菜发芽率均无显著影响，但复合污染则呈现出不同程度的联合毒性作用。对比单一 SM2污染，Cd加入后一定程度上增强了对生菜发芽的抑制；5 mg·L-1Cd + 10 mg·L-1SM2 处理发芽率比对照降低了7.14%，且差异达到显著水平（P＜0.05）；同时比单独5 mg·L-1Cd或单独10 mg·L-1SM2处理分别降低了3.70%和7.14%。

图1 SM2与Cd单一和复合污染对生菜发芽率的影响Fig.1 Germination rate of Lachica sativa L under single and combined treatment of SM2 and Cd

2.1.2 根长抑制率

根部是植物吸收营养的最重要的部分，当植物受胁迫时根部会首先作出响应，所以植物根的生长状态一定程度上可反映植物受毒害状况（王磊等，2017）。

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图2显示，单一Cd污染对生菜根长无抑制作用，而单一 SM2污染、复合污染对生菜根长均有抑制作用。由表1所示回归方程可计算复合污染下，Cd质量浓度为0、1、5 mg·L-1时，对应的根部SM2半抑制浓度依次为7.6、7.0、5.8 mg·L-1。这说明对比单一SM2污染，Cd的加入增强了SM2对生菜根伸长的毒性效应，从而降低了 SM2对生菜根伸长的半抑制浓度（IC50）。

根对植物吸收营养有重要作用，根长受到抑制的同时，植物可能通过调节根数目、根直径、根体积等来保证充足营养（韩航等，2016）。本研究中，SM2污染下生菜根长受抑制的同时，根表面积增大，根系变粗，以增加根系活力和与营养物质的接触面积来促进植物生长。

2.1.3 生菜生物量

生菜属叶菜类，地上部生物量远大于根部。如图3所示，单一Cd或SM2污染条件下，生菜生物量随着污染物浓度升高均出现先增加后降低的趋势。单独Cd处理下，当 Cd质量浓度为1 mg·L-1时，根系和地上部生物量最高分别比对照高73.93%、80.67%；Cd质量浓度增加至5 mg·L-1，根部/地上部生物量分别比 1 mg·L-1时显著降低了6.85%、26.42%，但仍然高于对照。单一SM2处理时，根系生物量随着SM2质量浓度由0 mg·L-1增加至 2 mg·L-1，根系生物量增加最多；而增至 10 mg·L-1时，根部、地上部鲜重分别比2 mg·L-1处理显著下降了65.98%、60.80%。复合污染下，对比单一SM2污染，地上部/根部鲜重均随Cd投加量增加而有所下降，但除 1 mg·L-1Cd+2 mg·L-1SM2处理外，其他处理均不显著。对比单一2 mg·L-1SM2处理，1 mg·L-1Cd+2 mg·L-1处理的根部生物量降低了55.62%，且差异达到显著水平（P＜0.05）。

图2 各处理生菜根生长情况Fig.2 Root growth of Lachica sativa L at different treatment

表1 不同质量浓度Cd处理条件下SM2对生菜根伸长抑制率影响的拟合方程Table1 Effects of SM2 and Cd on the inhibition rates to the root elongation of Lachica sativa L in combination

图3 SM2与Cd单一和复合污染对生菜生物量影响Fig.3 Biomass of Lachica sativa L under single and combined treatment of SM2 and Cd

2.2 Cd富集

SM2和Cd单一、复合污染处理下，生菜根部Cd质量分数始终高于地上部（图4）。单一Cd污染下生菜根部质量分数随Cd投加量增加而显著升高，Cd 投加质量浓度由 1 mg·L-1增至 5 mg·L-1，生菜根部Cd质量分数显著增加了591.41%，而地上部Cd质量分数增加了135.01%。

对比单一1 mg·L-1Cd处理，加入SM2的复合污染下，生菜根/地上部Cd质量分数随SM2投加量增加而递减，且SM2质量浓度为 2、10 mg·L-1的复合处理根Cd质量分数分别显著降低了41.15%、70.10%（图4a）。对比单一5 mg·L-1Cd处理，加入SM2后生菜根Cd质量分数显著大幅提高，5 mg·L-1Cd+2 mg·L-1SM2处理根 Cd质量分数最高，达1043.33 mg·kg-1；而对比单一 5 mg·L-1Cd 处理，SM2投加质量浓度为0.5、2 mg·L-1复合处理下，生菜地上部Cd质量分数显著提高3.98%、55.90%（图4b），地上部 Cd积累浓度最高值出现在 5 mg·L-1Cd+2 mg·L-1SM2 处理，为 127.42 mg·kg-1。

图4 生菜各组分Cd质量分数Fig.4 Accumulation concentration of Cd in different part of Lachica sativa L

图5 SM2与Cd单一和复合污染下生菜各组分SM2质量分数Fig.5 Mass fraction of SM2 in Lachica sativa L at different treatment

2.3 SM2富集

生菜根部 SM2积累质量分数大于地上部，如图5所示，SM2单一污染处理下生菜根部SM2积累随 SM2投加量增加呈现显著递增的规律；SM2投加质量浓度由 0.5 mg·L-1增至 2 mg·L-1，生菜根部、地上部SM2质量分数分别显著升高了54.03%、42.21%。对比单一SM2污染，加入Cd后SM2质量浓度为0.5、2 mg·L-1时复合污染的生菜根部SM2质量分数随Cd投加量增加而显著增加，但1 mg·L-1Cd+10 mg·L-1SM2处理生菜根部对SM2的积累浓度相对单一10 mg·L-1SM2污染有所降低，且差异显著（图5a）。

2.4 SM2质量浓度、Cd质量浓度及交互作用对生菜生长参数的双因素方差分析

本试验对SM2、Cd单一污染以及SM2与Cd复合污染对生菜各项指标的影响进行方差分析，结果如表2所示。

结果表明，复合污染下，Cd质量浓度对生菜发芽率、根长抑制率、根/地上部生物量、根/地上部Cd和SM2含量均有显著性影响（P＜0.05）；而SM2质量浓度对生菜根长抑制率、根/地上部生物量、根/地上部 Cd质量分数和根 SM2质量分数均有显著（P＜0.05）影响；SM2质量浓度和Cd质量浓度的交互作用对生菜根长抑制率、地上部生物量、根/地上部Cd质量分数和根/地上部SM2质量分数均有显著（P＜0.05）影响。

表2 SM2质量浓度、Cd质量浓度及交互作用对生菜生长参数的双因素方差分析Table2 Two-way ANOVE for the effects of SM2, Cd, and their interactions on growth parameters of Lachica sativa L

3 讨论

3.1 SM2与 Cd单一和复合污染对生菜发芽率、根长、生物量的影响

与空白对照相比，单一SM2处理对生菜种子发芽率无显著影响，这可能与生菜种子自身防护机制有关，生菜种子结构包括种皮、子叶、胚芽、胚根和胚轴，其中胚芽、胚根用于吸收营养，而种子发芽时所需营养物质源于子叶，且种皮起到了保护种子内部结构的作用，阻隔外界毒害物质。单一SM2处理对根长有抑制作用且随SM2投加量的增加而加强（表 1），这与相关研究结果类似（Michelini et al.，2012；刘娣，2010）。单一SM2处理下根/地上部生物量均呈现出先增加后减少的规律，表明生菜对较低浓度SM2有一定的耐受能力，且由于“毒物兴奋效应”，即由低剂量潜在有毒物质引起的刺激效应（Stebbing，1982），低浓度SM2处理生菜鲜重较空白对照有所增加，但随SM2质量浓度升高，胁迫作用加强，生菜生长受抑制，导致生菜生物量减少，与相关研究结果类似（刘兴坦，2002；赵秀侠等，2017；王盼亮等，2017）；但与空白对照相比差异不显著，这可能与植物的自我防御机制有关（Nour-eldinh et al.，2013；张继旭等，2017）。对比空白对照，单一 Cd处理与单一SM2作用相似，对生菜发芽率无显著影响；高质量浓度Cd（5 mg·L-1）对生菜生长有一定的抑制作用（Wu et al.，2014）。

对比单一SM2污染，Cd加入后5 mg·L-1Cd+10 mg·L-1SM2处理对生菜种子发芽抑制作用显著，这可能是由随水分扩散进入种子内的SM2和Cd复合毒性作用导致。Cd加入后，复合污染对生菜根长均抑制明显，SM2的IC50值下降，表明Cd的加入促进了SM2对生菜根长的抑制作用；这与马莎（2013）的研究结果重金属Cd与四环素复合时小白菜根生长受到抑制是一致的。复合污染对生菜的生长抑制有所加强，表现为地上部鲜重和根部鲜重有所减少，可能是由于复合污染根长受抑制，而根的生长对于营养物质的摄取有着重要作用，根长受抑制影响了生菜营养吸收，进而一定程度上降低了生菜生物量（陈苏等，2015）。

复合污染条件下毒性增强可能与SM2与Cd会形成络合物，以及络合物具有较强的生物毒性有关。有研究表明，SM2和Cd能形成络合物，不同pH条件下络合能力大小顺序为：pH 7.0＞pH 5.0＞pH 3.0，pH为5.0或3.0时，溶液中的Cd可以通过阳离子-π键的方式与被吸附的SM2发生1∶1络合；而在pH为7.0时，SM2主要以SM20和SM2-形式存在，通过阳离子-π键的形式或磺酰胺基上的H部分发生电离形成 SM2-后与 Cd发生 1∶1的络合反应（Tang et al.，2018）。SM2与Cd的络合物类似土霉素和环丙沙星与重金属形成的配合物，有毒性实验证明这类配合物具有更高毒性，对细菌，藻类生长具有强抑制活性（Yu et al.，2015；Zhang et al.，2012），主要起浓度加成作用（Maslin et al.，2000），这可能也是Cd加入一定程度增强了SM2对生菜根长抑制作用的原因。

3.2 SM2与 Cd单一、复合污染对生菜富集SM2/Cd的影响

Cd/SM2主要积累在植物的根部，并能通过中柱向地上部传输，单一SM2/Cd处理下生菜SM2/Cd吸收富集与SM2投加量有关，根SM2/Cd富集随SM2/Cd投加量增加而显著升高，呈现出明显的剂量-效应作用；地上部 Cd/SM2积累量有所增加但不显著，这可能与作物的自我调节作用有关。而复合污染Cd与SM2交互作用显著影响了生菜富集Cd/SM2（表2）。总体而言，复合污染下根/地上部Cd富集呈高 Cd质量浓度（5 mg·L-1）协同，低Cd质量浓度（1 mg·L-1）根部Cd富集拮抗的规律。这可能与Cd与SM2络合物的毒性效应以及植物根系对Cd的吸收机制有关。

植物由于自身防御机制对重金属等有毒物质往往表现出防御和排斥机制，植物根部对水溶液中Cd存在排斥作用，限制根系吸收和从根系向地上部运输；或具有主动向细胞外外排有毒离子的能力。细胞壁木质化、木栓化增厚可阻挡有害物质进入细胞内（Hao et al.，2014），此时根仅吸收自由Cd离子。而低浓度Cd/SM2复合污染时，由于SM2的加入，与Cd形成络合物降低了溶液中自由Cd浓度；因此表现出拮抗效应。然而，随着水溶液中 Cd/SM2投加量增加，形成的 Cd-SM2络合物毒性增强，导致根结构的完整性被破坏，这种植物防御作用受破坏；更多的Cd透过破损的根细胞膜或通过破损的凯氏带进入中柱；并在高浓度时吸收完整的金属络合物（Collins et al.，2002；Degryse et al.，2006；Oporto et al.，2009），随后在扩散层内离解，从而补偿游离金属的损耗，增强扩散通量（Jansen et al.，2002；Verheyen et al.，2012），这可能也是高浓度Cd植物体内积累浓度更高的原因。

植物对SM2的吸收可能与根系与化合物的亲和力有关，菜根为须根系，根部具有较高的比表面积，对SM2具有较高的亲和力（Khan et al.，2011）。研究表明，Kow为0.5－3的中度疏水性化合物最易被植物吸收和转运至地上部（陈怀满，2002），因此 SM2更易吸附在根表，进而被根吸收。SM2和Cd络合后可能会改变生菜根对SM2的亲和力以及生物可利用性；此外，Cd的存在可能会与SM2竞争根部细胞表面结合位点，导致根部 Cd积累的减少，SM2的积累增多（高若松，2011）。与单一低、中质量浓度 SM2（0.5、2 mg·L-1）相比，Cd与SM2络合，改变了根对SM2的配合力，促进积累作用（Lu et al.，2014），且这种促进作用随Cd添加量增加而增强。根的外观特征也呈现相应的变化，中、低质量浓度 SM2（2、0.5 mg·L-1）与 1 mg·L-1Cd 复合处理会诱导产生更多的根以及使根变粗（见图2），改变根对SM2的亲和力以及积累效应。马莎（2013）的研究也有类似发现，当四环素浓度低于 2.5 mg·L-1时，3 mg·L-1Cu2+复合胁迫对小白菜地上部四环素的累积作用比 1 mg·L-1Cu2+明显。与单一 10 mg·L-1SM2 相比，SM2投加质量浓度相对较高（10 mg·L-1）时，Cd的加入会降低生菜根部SM2的积累，这与Lin et al.（2008）的研究结果类似，其研究发现Cu胁迫对嵌二萘（Pyrene，PYR）抑制了玉米对 PYR的富集，并推测可能是Cu胁迫下根系生理的改变不利于PYR的积累。抗生素金属络合不可忽略络合作用毒性，Cd和 SM2络合可能会导致协同毒性作用（金彩霞等，2010）。本研究中，10 mg·L-1SM2+Cd处理的生菜根生长受抑制，根长、根表面积、根数目均减少（图2），影响了根系对SM2的亲和力，进而影响SM2的积累。其协同毒性作用还有可能会影响植物向上传输的功能，导致SM2由根部向地上部的传输减少，地上部SM2质量浓度有所降低。

由此可见，复合污染条件下，植物对污染物的富集不仅取决于自由离子的活性，还与污染物性质和污染物组合、质量浓度组合、植物自身特性也有关。在对环境风险进行评估时，不能只考虑单一的SM2和Cd产生的生态风险，复合污染条件下两者的相互作用以及络合作用也不容忽视。

4 结论

（1）对比空白对照，单一Cd/SM2污染对生菜种子发芽、根生物量均无显著影响，而 SM2对生菜根伸长具有一定的毒性效应；Cd/SM2复合污染存在协同毒性作用，Cd加入增强了SM2对生菜根伸长的抑制效应。

（2）单一污染条件下，生菜对SM2与Cd的吸收积累随着污染物浓度的增加呈现显著的剂量效应；而SM2/Cd复合污染条件下，低浓度Cd时，SM2的加入对生菜吸收和积累 Cd表现出拮抗作用；但高浓度Cd处理下，SM2加入可以促进生菜对Cd的吸收和积累。相反地，SM2/Cd复合污染条件下，低浓度SM2时，Cd的加入对生菜吸收和积累SM2表现出协同作用；但高浓度SM2处理下，Cd加入可以抑制生菜对SM2的吸收和积累。

（3）Cd/SM2在生菜植物中的富集和迁移不仅受其性质、投加量以及质量浓度组合影响，还受两者相互作用的影响。