不同测定方法探讨重金属对微生物毒性的影响

2019-02-26梁玉兰张小华

生态环境学报 2019年1期

梁玉兰，张小华

1. 闽西职业技术学院，福建龙岩 364021；2. 江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013

随着工业化进程的加快，各大城市纷纷建立工业区集中水处理设施，减轻了城市污水处理系统及地表水的负担（王凯军等，2001；余杰等，2007；Vachováp et al.，2017）。然而，受到城市规划的历史影响，有时工业废水会流入城市生活污水处理系统中，容易对其中的微生物造成影响，并且降低活性污泥的处理效率。在城市废水的集中生化处理过程中，活性污泥法由于低价高效而被普遍使用。而活性污泥法中，微生物是有机污染物的主要分解者，当重金属存在时，会对活性污泥处理系统造成很大影响（赵庆良等，2006；竺建荣等，1999；Goronszy et al.，1996）。活性污泥法被广泛应用于城市污水和工业废水的集中生化处理中，其本质是污泥微生物通过氧化水中的有机物质，产生维持自身生存和增长的能量，同时达到降解有机物、净化水质的目的（竺建荣等，1999；Rodrãguez et al.，2018），这也是防止工业污水进入城市污水处理系统的最主要手段之一。因此，活性污泥法被广泛应用于城市废水的集中生化处理过程中。在活性污泥生物处理过程中，微生物生命活动需要大量的营养物质，其中就包括作为酶的活性剂与活化剂的微量重金属（刘锐等，2001；李娟英等，2009；Jacob et al.，2018）。

微生物是污水处理工艺中污染物的重要分解者，重金属对活性污泥微生物的毒性研究也一直备受关注（李娟英等，2009；刘新春等，2005），重金属对微生物的毒害作用可导致处理系统的微生物种群结构发生改变，影响污水处理效果。近年来不少学者开展了重金属毒性带来的污水处理影响机理，并提出了相应的检测方法，探究重金属对微生物结构和活动产生的作用（蒋成爱等，2001；吕锡武，2001），但是所提出的观点不尽一致，研究视角也不尽相同。由于测定方法不统一，且每种方法都有其优缺点和适用条件，导致很多的研究结论差别很大，有的甚至相互矛盾（谢冰等，2003；Wei et al.，2010；Miśkowiec et al.，2015；Yang et al.，2018）。从目前的研究成果来看，在重金属对生态环境的毒性影响方面最常用的毒性测定方法是生物试验法，即通过生物体或细胞的存活时间和繁殖量来判断毒性的大小，从而获得重金属毒性的相关信息。由于重金属对活性污泥微生物的毒性与化学反应速率和微生物生长速率有关，单一采用生化法或生物法测得的结果无法为活性污泥工艺运行提供科学指导。鉴于此，笔者以活性污泥为受试对象，研究了 4种常见重金属对污泥活性及微生物的影响，尝试运用不同测定方法来研究重金属对活性污泥微生物的毒性，以期为污水生物处理工艺运行和设计管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

药剂：ZnCl2、PbCl2、CdCl2、HgCl2、CuSO4、Pb(NO3)2、Hg(NO3)2、氯化三苯基四氮唑（TTC）标准溶液，均为分析纯。

细菌：502发光细菌冻干粉，来源于福建省农科院。

活性污泥：活性污泥脱氢酶毒性实验和硝化抑制毒性实验中所用活性污泥分别取自城市污水处理厂A/O工艺的A段和O段（具有硝化功能的活性污泥）。该污水处理厂接纳的污水中，90%是生活污水，10%为工业污水，主要包括食品加工厂、物流冲洗污水和餐饮污水，挥发性悬浮固体（VSS）浓度与总固体悬浮物（SS）浓度之比约为0.71，污泥沉降指数（SVI）为78－109，pH为7.8。

模拟废水：采用葡萄糖、奶粉、磷酸二氢钾、氯化铵配制，4 种物质的比例为 20∶5∶5∶1，CODCr为 600 mg·L-1左右，浓度为 50 mg·L-1，4 ℃保存。

重金属溶液：配制重金属浓度为1.0 g·L-1的溶液，备用。

主要仪器：ET-99718微电脑化学需氧量测定仪；YSI-5000DO测定仪；岛津UV-2450紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 一次暴露试验

取离心（3000 r·min-1，20 ℃）后的活性污泥30 g加入1500 mL曝气反应器中，然后分别加入含不同浓度重金属的模拟废水1000 mL，充氧曝气24 h，反应后采用MLSS型悬浮物（污泥）浓度计（德国，MLSS10AC+MLSS-S0C10）测定该活性污泥系统的污泥沉降指数（SV30）、活性污泥中悬浮固体含量（MLSS），并计算污泥体积指数（SVI）：SVI=SV30/MLSS；使用显微镜观察污泥中的生物相；静置沉淀60 min后取上清液测CODCr值；最后测定反应后活性污泥的脱氢酶活性、活性污泥的耗氧速率（活性污泥耗氧速率测定仪，美国，AER-208），所有试验维持曝气量不变。

1.2.2 中毒污泥二次培养试验

采用二次培养试验检验重金属中毒活性污泥经短时间培养后的活性恢复情况。从曝气反应器中取出活性污泥混合液，离心后弃上清液。并使用蒸馏水洗涤3次，加入不含重金属的模拟废水，曝气反应24 h，然后测定废水CODCr值及活性污泥的耗氧速率。

CODCr采用快速COD测定仪检测；耗氧速率采用YSI5000 DO测定仪测定；脱氢酶活性采用岛津UV-2450紫外可见分光光度计测定，其作用原理为：无色的2, 3, 5-三苯基四氮唑氯化物在脱氢酶作用下可转化为红色的三苯甲基（TF），因此，通过检测TF的产生量可间接评价污泥脱氢酶的活性。

1.2.3 活性污泥脱氢酶毒性测定

（1）TTC标准曲线绘制（李光伟等，2007）

分别取TTC质量浓度为0、20、40、60、80、100、120、140 μg·mL-1的标准溶液各 1.0 mL，置于10 mL离心管中，再加入2 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液、1 mL质量分数为10%的 Na2S溶液和 1 mL蒸馏水；将离心管置于37 ℃恒温水浴中振荡30 min，加入0.5 mL甲醛，再加入5 mL质量分数为80%的丙酮，在37 ℃恒温水浴振荡10 min，萃取完毕后，于4000 r·min-1离心5 min，取上清液于分光光度计485 nm处测定吸光度；以TTC质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算TTC还原产物三苯甲基（TF）的生成量。

（2）活性污泥脱氢酶毒性试验

将活性污泥先曝气24 h，以保证所有外源基质被耗尽，然后取适量污泥混合液，用蒸馏水洗涤 2次后加水稀释，将MLSS控制在2000 mg·L-1左右，从中取一系列体积为50 mL的污泥混合液样品，并测定样品的初始活性污泥脱氢酶活性；为消除 pH对实验结果的影响，用磷酸盐缓冲溶液将样品的pH调节为 7.2；根据样品的重金属浓度梯度，向样品中加入不同量的重金属化合物，并保持样品总体积不变；将样品振荡2 h后，测定抑制后的活性污泥脱氢酶活性，同一污泥混合液样品平行测定3次。

取1 mL污泥混合液样品置于10 mL离心管中，依次加入2 mL Tris-HCl缓冲溶液、0.5 mL质量浓度为0.1 mol·L-1的葡萄糖溶液和0.5 mL质量分数为0.4%的TTC溶液；并迅速将制备好的样品放置于 37 ℃恒温水浴中振荡 2 h，然后加入 0.5 mL甲醛终止反应；于4000 r·min-1离心5 min后去除上清液，加入5 mL萃取剂，于37 ℃恒温水浴振荡10 min；萃取完毕后再于4000 r·min-1离心5 min，取上清液于分光光度计485 nm处测定吸光度；取经离心的沉淀污泥在105 ℃烘干2 h测其质量。活性污泥脱氢酶活性的计算如下（周立祥等，2001）：

式中，ETS 为脱氢酶活性，单位为 μg·mg-1·h-1；D485为485 nm处吸光度；V为萃取剂体积，单位为mL；ki为TTC曲线斜率；W为陈定污泥干质量，单位为mg；t为脱氢酶培养时间，单位为h。

通常借助Logistic方程计算重金属影响下的脱氢酶活性，具体公式如下：

式中，x为重金属的质量浓度，mg·L-1；y为TF的质量浓度，μg·mL-1；x0为重金属的半数有效浓度（EC50），mg·L-1；k为x=0时所对应的y值，即是空白对照组的TF，μg·mL-1；b为经验系数。

1.2.4 硝化抑制毒性测定

（1）硝化抑制毒性实验

以富集培养的活性污泥作为受试对象，测定在不同浓度重金属影响下的活性污泥硝化速率。所有实验均在恒温 20 ℃水浴锅中进行，在水浴锅中放置1000 mL的大口试剂瓶作为反应器，pH控制在8.0左右，水中DO保持在4.0－5.0 mg·L-1。在反应器中加入不同浓度的重金属化合物，并间隔一定的时间取适量体积的污泥混合液样品，分别测定氨氮浓度并绘氨氮浓度随反应时间的变化图。

（2）数据处理

对氨氮浓度随反应时间的变化图进行求导，得出不同重金属浓度条件下的活性污泥硝化速率，再根据重金属浓度对硝化速率影响的修正 Monod方程求重金属的 EC50。其计算公式为（周立祥等，2000；Miśkowiec et al.，2015）：

式中，q为硝化抑制率，%；p为 q=50%时重金属的质量浓度，mg·L-1；a为最高硝化抑制率，%。

1.2.5 发光细菌毒性测定

发光细菌毒性测定方法参照 GB/T 15441－1995，反应时间调整为30 min。

2 结果与分析

2.1 重金属对污泥活性的影响

2.1.1 重金属对活性污泥CODCr去除率的影响

由图1可知，在不同浓度条件下，4种重金属均可使污泥系统的 CODCr去除率下降。其中，Cd和Hg对CODCr去除率的影响最明显（其变化幅度较大），这2种金属浓度为50 mg·L-1时，对系统的处理能力产生很大影响，CODCr去除率均降至50%以下；而Zn和Pb对活性污泥CODCr去除率的影响较小。

图1 重金属对活性污泥CODCr去除率的影响Fig.e 1 Effects of heavy metals on removal rate of CODCr of activated sludge

2.1.2 重金属对活性污泥微生物脱氢酶活性的影响

重金属浓度与活性污泥脱氢酶活性的 Logistic回归方程拟合参数如表1所示，由表可知，4种重金属与活性污泥脱氢酶活性的Logistic回归方程均达到极显著水平（P＜0.01），就 k值而言，Cd和Pb实测值显著高于Hg和Zn（P＜0.05）；EC50大致表现为 Pb＞Zn＞Cd＞Hg，其中不同重金属 EC50差异均显著（P＜0.05）；就b值而言，Hg显著高于其他重金属（P＜0.05），而其他3种重金属差异不显著（P＞0.05）。

不同重金属对TF生成量的影响如图2所示，由图可知，不同重金属对TF生成量的影响较大，4种重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度均随着重金属浓度的增加而降低，表现为 Cd＞Hg＞Zn＞Pb。此抑制程度大小顺序与发光细菌的发光强度抑制率大小顺序有所不同，Cd对活性污泥脱氢酶活性的抑制作用大于Hg，Pb和Zn的EC50测定结果稍微偏大。

2.1.3 重金属对系统SVI的影响

由图3可知，4种重金属对活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而升高，较低浓度重金属对活性污泥SVI值影响并不大，相同浓度下重金属对系统SVI的影响大致表现为 Hg＞Cd＞Pb＞Zn。

表1 重金属浓度与活性污泥脱氢酶活性的Logistic回归方程拟合参数Table1 Parameters of Logistic regression equation for heavy metal concentration and dehydrogenase activity

图2 重金属浓度对TF生成量的影响Fig.2 Effect of heavy metals concentration on TF generation

图3 重金属浓度对SVI的影响Fig.3 Effects of heavy metal concentration on SVI

2.2 重金属对污泥微生物毒性的影响

2.2.1 重金属对发光细菌的毒性的影响

测定了Hg、Cd、Zn和Pb 4种重金属对发光细菌的毒性，结果见图 4，由图可知，发光细菌的发光强度抑制率与重金属的对数呈极显著的线性相关关系（P＜0.01），即发光细菌发光强度随重金属对数浓度的增大而呈下降趋势。因此，在给定重金属浓度的情况下，可以根据剂量-效应回归方程计算发光细菌的发光强度抑制率。

通过上述发光细菌的发光强度抑制率与重金属的对数浓度的线性相关分析，将重金属对数浓度（lg x）和发光细菌发光强度抑制率（i）进行回归分析，得到剂量-效应回归方程和重金属的EC50（见表2）。由表可知，4种重金属对发光细菌发光强度的抑制程度表现为 Hg＞Cd＞Zn＞Pb。

2.2.2 重金属对硝化抑制的毒性

重金属浓度对活性污泥硝化速率的影响见图5，对实验结果进行Monod方程拟合，由图5可知，4种重金属对活性污泥硝化速率的抑制程度表现为Cd＞Hg＞Zn＞Pb，与重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度大小顺序一致。

2.2.3 重金属毒性测定结果的比较

图4 重金属对数浓度与发光细菌发光强度抑制率关系Fig.4 Effect of heavy metals logarithmic concentration on the inhibition rate of luminescent bacteria

表2 重金属对数浓度与发光细菌抑制率的剂量-效应回归分析Table2 Table2 Parameters of Logistic regression equation for heavy metal concentration and dehydrogenase activity

图5 重金属浓度对硝化抑制率的影响Fig.5 Effect of heavy metals on the nitrification inhibition rate

图6 不同重金属毒性测定方法的测定结果比较Fig.6 The results of bio-toxicity for four kinds of heavy metals

利用不同重金属毒性测定方法得到的重金属毒性结果不尽相同。由图6可知，不同测定方法得到的每种重金属的EC50差异较大，有的甚至差1－5个数量级，这可能和不同测定方法本身的特点及测定条件有关。与发光细菌毒性测定相比，活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性测定的灵敏度有些偏低。就重金属Hg的EC50而言，发光细菌毒性、脱氢酶毒性和硝化抑制毒性基本表现为脱氢酶毒性＞发光细菌毒性＞硝化抑制毒性，其中脱氢酶毒性与发光细菌毒性差异不显著（P＞0.05），发光细菌毒性和硝化抑制毒性差异不显著（P＞0.05）；就重金属Cd的EC50而言，基本表现为硝化抑制毒性＞脱氢酶毒性＞发光细菌毒性，其中不同细菌毒性差异均不显著（P＞0.05）；就重金属Zn和Pb的EC50而言，基本表现为脱氢酶毒性＞硝化抑制毒性＞发光细菌毒性，其中不同细菌毒性差异均显著（P＜0.05）。

3 讨论

本研究中，在不同浓度条件下，4种重金属均可使污泥系统的 CODCr去除率下降。其中，Cd和Hg对CODCr去除率的影响最明显（其变化幅度较大），而Zn和Pb对活性污泥CODCr去除率的影响较小，这与 Zn和 Pb在水中的离子形态有关，Zn和Pb可与溶液中的OH-结合，形成各种不具备生物活性的配位化合物。不同重金属的外层电子排布不同，价态和离子半径也有所区别，这对TF生成量的影响较大，并导致其对活性污泥脱氢酶活性的抑制能力产生较大差异。此外，由图6可知，4种重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度均随着重金属浓度的增加而降低，Cd对活性污泥脱氢酶活性的抑制作用大于Hg，这可能与Hg在溶液中可以形成多种配位化合物，进而影响其生物毒性，而Cd在溶液中通常以Cd2+或稳定性较低的络合态存在，不会对其生物毒性产生较大的影响有关。Pb和Zn的EC50测定结果有些偏大，可能与这2种重金属在水中的存在状态有关，Pb和Zn可与溶液中的OH-结合，形成多种形式的配位化合物，另外由于金属离子浓度较高时，会导致其与活性污泥颗粒上的H+产生交换，造成溶液 pH升高，OH-浓度升高，从而导致游离态的重金属离子浓度降低。因此溶液中的Pb或Zn浓度表征的并不完全是具有生物活性的游离态离子浓度，故Pb和Zn的EC50测定结果偏大。

4种重金属对活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而升高，当重金属浓度较低时，对活性污泥SVI值影响并不大，其原因可能是：（1）重金属影响了活性污泥内微生物的细胞活性，降低了微生物自身的絮凝作用（镜检发现，重金属存在时，活性污泥中的菌群发生变化，可能由于耐毒性较强的丝状菌的存在使得活性污泥发生膨胀）；（2）重金属大量存在时，重金属可置换出活性污泥中的H+，从而使环境pH值发生一定程度的下降，进而使活性污泥的沉降速度变慢（卢培利等，2008）；因此在低浓度条件下，活性污泥 SVI随重金属浓度增加变化不大，而高浓度条件下，活性污泥SVI值随重金属浓度的增加而显著增加。4种重金属对活性污泥硝化速率的抑制程度表现为 Cd＞Hg＞Zn＞Pb，与重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制程度大小顺序一致，这可能和这2种测定方法的受试对象是活性污泥，重金属对活性污泥产生毒性的机理与发光细菌有所区别有关。活性污泥的硝化速率受重金属毒性的影响比活性污泥脱氢酶活性更为敏感，而且其影响可量化，便于测定，因此可以作为污水脱氮工艺受重金属毒性影响的指示指标。但因硝化细菌是一类比较敏感的菌群，受各种环境条件的影响较大，因此活性污泥的硝化速率是否可做为单一的重金属毒性的终点指示指标还有待进一步验证。

本研究中，不同测定方法得到的每种重金属的EC50差异较大，有的甚至差 1－5个数量级，这可能和不同测定方法本身的特点及测定条件有关（图6）。与发光细菌毒性测定相比，活性污泥脱氢酶毒性和硝化抑制毒性测定的灵敏度稍微偏低，这可能和污水处理工艺的实际运行条件有关，进入污水中的重金属经过各种转化，如沉淀，被有机质、矿物质吸附或被水中大量无机（Cl-、OH-、NH3）及有机配位体（如腐殖酸）络合而导致移动性降低，从而使重金属的存在形态和毒性发生变化，导致重金属毒性的测定结果产生偏差（陈同斌等，2003；谢冰，2002）。重金属使发光细菌的发光强度降低，是由于其影响了发光细菌发光酶的催化代谢途径；而重金属对活性污泥脱氢酶活性的抑制，是由于有机污染物中活化的 H+通过活性污泥的电子传递体系传递给特定的受氢体的过程受到了影响；而硝化速率受到抑制主要是因为硝化限速步骤氨氧化过程中的氨单加氧酶（AMO）的活性受到了影响（谢冰，2002）。由此可知，重金属毒性测定方法、毒性评定对象的差异导致评定结果的差异，因此在实际运用中，应当根据具体的工艺原理和毒性评定对象特征，选择合适的重金属毒性测定方法。

由以上分析表明，多种重金属毒性终点指示指标均可以提示重金属对活性污泥微生物的毒性，例如，抑制BOD5或CODCr速率、活性污泥呼吸速率、活性污泥脱氢酶活性、活性污泥硝化速率及其细菌发光强度等，选择终点有效的指标对重金属对活性污泥微生物毒性进行评价，这逐渐成为众多研究学者的共识。为了正确判断重金属对活性污泥微生物毒性的影响，应该选择不同的毒性指标进行多组毒性测验，不能将发光细菌发光强度的抑制指标作为主要的判断标准，也不能仅仅追求速度，假如夸大重金属对污水的处理能力，这将造成处理污水成本大幅度上涨。