SerpinD1的研究进展

王 心，金 海，庹必光

(遵义医科大学附属医院消化内科，贵州 遵义 563000)

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,Serpin) 是体内最大的蛋白酶抑制剂超家族，分布于全身组织，其可因分布位置的不同而发挥不同的生物功能[1]。研究表明，Serpin家族成员因构象改变和聚合现象的发生而导致多种疾病[2]，如SerpinB5的突变与肿瘤相关，SerpinI1基因突变与阿尔茨海默病相关等。SerpinD1是Serpin超家族中的重要一员[3]，又称为肝素辅因子Ⅱ。研究显示，该基因与凝血系统、血管损伤、炎症反应、肿瘤等相关[4-5]。在炎症中，SerpinD1主要是通过基因上的P6位点产生对炎症细胞的趋化作用，其发挥抗凝血酶作用的条件之一是有肝素的存在。在非小细胞肺癌中，SerpinD1具有促进细胞运动和转移的作用；且学者预测SerpinD1在非小细胞肺癌中是一种新的转移增强剂，可作为肝素治疗非小细胞肺癌的预测因子[6]。SerpinD1增强了肺癌细胞中的肌动蛋白成核和聚合现象，这与在癌症治疗中使用肌动蛋白或成核因子作为治疗靶点的观点相一致[7]。有研究显示，SerpinD1还与系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等疾病有关[8]。现就SerpinD1的研究进展予以综述。

1 Serpin

Serpin是学者于1980年依据卵清蛋白和人抗凝血酶等蛋白的一级结构的保守性提出[9]。Serpin超家族分布广泛，可分布在细胞外和细胞内，但两者的生物功能不同，因作用方式的不同或铰链区的保守性Serpin可分为抑制型和非抑制型[10]。迄今为止，已发现了400多种Serpin超级家族的成员，包括A～P亚型，其中有36个编码人蛋白质的基因及5个假基因[11-12]。按照系统发育分析，人Serpin家族成员分为9枝(A～I)[13-15]。

天然Serpin是一种亚稳态蛋白，能通过构象改变发挥抑制靶酶的作用，但结构较易发生自发性重排，故称之为自身聚合现象[16]。这些现象的发生使得Serpin容易发生突变，导致蛋白质错误折叠、无活性聚合物的形成等，已证实一些Serpin家族成员因构象改变和聚合导致疾病[2]。Serpin病就是其中的一种。越来越多的研究发现，编码Serpin的基因发生突变与多种人类疾病有密切联系，如SerpinA3基因发生突变与肺气肿相关，SerpinD1的基因突变与血栓的发生有关等[4-5，17]。

2 SerpinD1

SerpinD1是一种单链抗凝血酶糖蛋白，其分子量约为65 000[18]。SerpinD1含有480个氨基酸残基，约30%的氨基酸序列与家族其他成员相似；SerpinD1与家族其他成员最大的区别在于它的N端是一个酸性结构域，氨基酸残基约80个，其中阴离子酸性氨基酸残基重复序列是SerpinD1作为极强凝血酶抑制剂的原因之一。在加快糖胺聚糖催化抗凝血酶发挥作用的过程中，SerpinD1的两个酸性结构域即酸性区-1和酸性区-2的作用不可或缺。

2.1 SerpinD1与炎症和肿瘤的关系 SerpinD1介导炎症反应是通过它的P6位点与中性粒细胞释放的弹性蛋白酶相互作用后使SerpinD1失去抗凝血酶作用，且SerpinD1分解出的N端多肽片段会对炎症细胞起到趋化作用，从而加重炎症反应。有学者通过用特定氨基酸取代P6位点中的缬氨酸后发现，这种变异型的SerpinD1基因能在几乎不影响其本身抗凝血酶作用的基础上大大降低炎症反应[18]。如在发生细菌性败血症时，中性粒细胞被激活，释放大量弹性蛋白酶，而这些蛋白酶会与SerpinD1反应，使其发生水解，趋化大量炎症细胞聚集，加重组织损伤。变异型的SerpinD1在机体发生该病的过程中发挥两方面的作用，既可以抑制抗凝血酶活性的减弱，从而缓解抗凝和凝血过程的失衡；也可以抵抗弹性蛋白酶的水解作用，且变异型的SerpinD1抑制炎症反应的效果是野生型的10倍，因此在临床中具有广泛的应用前景[18]。

癌细胞的异常增殖和远处转移是个十分复杂的过程。与正常机体形成的每个组织均由固定数量的细胞构成且具有精准的秩序相比，癌细胞会根据周围的环境来决定自身是否需要分裂、增殖。细胞死亡的同时会有同样数量的细胞生成，一旦由新分裂产生得到的新细胞数量超过死亡细胞，就有可能导致肿瘤的发生。有文献报道，肿瘤某种特定的生物学行为使得正常的凝血、抗凝和纤维蛋白溶解系统之间失去平衡，导致肿瘤组织的局部抗凝、纤维蛋白溶解作用明显弱于促凝作用，使得纤维蛋白在肿瘤的局部不断沉积，从而导致肿瘤对机体的免疫杀伤无反应[19]。因此，研究肿瘤发生发展与SerpinD1抗凝作用之间的关系，切断疾病发生的重要环节，恢复凝血与抗凝的平衡，对肿瘤的治疗具有重要意义。

有研究者在癌症基因组解剖学项目中通过对基因表达数据库的序列进行分析发现，SerpinD1在非小细胞肺癌中表达量高；且进一步深入研究发现，在非小细胞肺癌中SerpinD1具有促进细胞运动和转移的作用[16]。在非小细胞肺癌中，细胞的存活、生长和迁移是SerpinD1通过Rho鸟苷三磷酸酶的两个成员Rac1和Cdc42来调节[20]。但SerpinD1刺激这两者的活性可被磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002所抑制。这证明了，磷脂酰肌醇-3-激酶是SerpinD1的下游效应器，并作用于Rac1和Cdc42的上游。在Serpin超家族中，SerpinB1参与了肝癌的发生发展，且具有促进肝癌细胞转移的作用[21]。肝癌死亡的主要原因为5年生存率较低，死亡人数约10余万人/年[22]。

肝癌的发生发展与多种抑癌基因的失活及癌基因的过度激活密切相关[23]。目前肝癌治疗仍以手术为主，放疗和化疗为辅，但因肝癌缺乏特异性症状和体征，发现时已是晚期，即使采取积极治疗措施，预后仍较差，多数患者因肿瘤转移及复发致死。所以，进一步寻找更多与肝癌发生发展相关的基因是目前迫切需要解决的问题[24]。肝癌恶性程度高、难发现、进展快、预后差，是由于肝癌细胞增殖快且具有高度血管侵袭及肝内外转移的特点[25]。因此，寻找细胞侵袭转移相关蛋白与肝癌进展的相关性是目前的研究重点之一。由于SerpinD1 在肺癌中有促进肿瘤转移及侵袭的特点，且其主要由肝脏合成，所以可以从细胞水平、功能学试验、建立肝癌动物模型去探讨SerpinD1在肝癌发生发展中的作用，进一步了解该基因功能结构改变与肝癌发生发展及恶性程度之间的关系，明确SerpinD1在肝癌中是否具有促增殖、侵袭转移的作用。

2.2 SerpinD1与凝血系统和血管损伤的关系 抗凝血酶-Ⅲ(antithrombin-Ⅲ,AT-Ⅲ)和SerpinD1均是Serpin超家族成员，当病变促发异常凝固时，它们会发挥一定的抗凝作用，并能很好地调节血液纤维蛋白溶解系统。有研究对SerpinD1的免疫化学特性及其交叉免疫电泳图进行分析表明，在免疫化学特性方面SerpinD1与AT-Ⅲ存在异质性[26]。在肝素存在条件下，SerpinD1通过以共价键方式与凝血酶活性中心丝氨酸残基的羟基形成1∶1的稳定复合物，使凝血酶失去水解蛋白酶的作用；但由于SerpinD1需在血管外发挥作用，所以与AT-Ⅲ相比，其抗凝作用比较专一[26]。此外，SerpinD1与肝素的亲和能力较低，达到同样的抗凝能力所需的肝素水平远高于AT-Ⅲ，但若肝素水平继续升高，SerpinD1的抗凝血酶活力并不会提高。

肝素是SerpinD1发挥抗凝血酶作用的条件之一，而使其活化的另一个重要辅因子为硫酸皮肤素。它的适量存在可以使SerpinD1的抗凝血酶效果明显增强，能使抗凝反应加快1 000倍[18]。有文献报道，在硫酸皮肤素的特定部位选择性结合硫酸基团，即可成为SerpinD1激动剂，这种激动剂能够增强SerpinD1的催化活性，且较SerpinD1有更高的可溶性和特异活性。SerpinD1激动剂对病理状态下的血管内皮增生具有抑制作用，也能作用于黏附在血管内皮表面的凝血酶，但其治疗动脉粥样硬化需进一步研究。有文献报道，SerpinD1的活性与内皮血管舒张功能呈正相关，且血浆SerpinD1活性可作为疑似冠心病患者未来心血管事件的预测因素[27]。此外，SerpinD1在白细胞弹性酶降解后释放白细胞化学诱肽，会促进血管生成以应对贫血[28]。

在人身体的不同部位均存在抗凝血系统，AT-Ⅲ和SerpinD1均主要产生抗凝血作用。在人体血浆中，AT-Ⅲ的存在抑制了血栓的形成。当AT-Ⅲ赖氨酸残基与肝素共存时，AT-Ⅲ参与灭活凝血酶的速度加快，可见肝素对提高AT-Ⅲ活性有一定作用[29]。在AT-Ⅲ功能正常的情况下，SerpinD1缺陷对血栓形成几乎没有影响。但有研究者将人体不同组织中的SerpinD1和AT-Ⅲ水平进行对比发现，SerpinD1在肝组织内占优势，而在胎盘组织内SerpinD1/凝血酶和ATⅢ/凝血酶的水平相当[30]。且SerpinD1在脑组织、肌肉组织、肺组织、内分泌组织(甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)、肾脏、膀胱、大部分女性生殖系统中的水平较低，在肝组织中含量丰富[31]。可见，SerpinD1的表达具有组织特异性，其需在特定组织内接受相应的刺激才能发挥对凝血酶的调节作用，也能在特定的病理环境下因所受到的刺激发挥作用。因此，对SerpinD1的研究有助于认识其参与凝血及血栓形成的过程，为药物的选择和疾病的治疗提供参考。在临床抗凝治疗中，为了有效降低血栓性疾病的发病率，血浆中AT-Ⅲ和SerpinD1水平的有效检测具有重要意义[8]。研究显示，检测血浆SerpinD1水平的方式主要有两种：SerpinD1活性检测和SerpinD1的抗原水平测定[26]。

2.3 SerpinD1与其他疾病的关系 有实验证明，培养的人肝细胞能够合成SerpinD1[32]。在肝病情况下，SerpinD1水平降低。Tollefsen和Pestka[33]观察到8例无弥散性血管内凝血肝功能衰竭患者的SerpinD1 水平降低，且与血清白蛋白水平降低呈正相关，提示SerpinD1的合成与肝脏相关。Tran和Duckert[34]报道的7例弥散性血管内凝血患者中有6例患者的SerpinD1抗原水平及活性均降低，且SerpinD1水平的降低与AT-Ⅲ水平的降低呈正相关。但弥散性血管内凝血时SerpinD1水平的降低机制尚不清楚，是否与SerpinD1继发性消耗增加有关有待进一步研究。有研究显示，SerpinD1在1型糖尿病与2型糖尿病的活性不一样，它在1型糖尿病中的活性低，且有高凝和低纤维蛋白溶解状态，与1型糖尿病患者发生的心血管病变具有相关性；而SerpinD1在2型糖尿病中的活性并没有改变，其具有高凝状态，但没有低纤维蛋白溶解状态[14]。有研究提示，系统性红斑狼疮和类风湿关节炎患者可能有凝血-抗凝血失衡，且他们的SerpinD1和AT-Ⅲ的水平均较正常低，提示 SerpinD1和AT-Ⅲ可能参与了系统性红斑狼疮和类风湿关节炎患者的凝血-抗凝血过程[9]。另外，SerpinD1还可作为妊娠高血压综合征高凝状态判断的分子标志物[18]。

3 小 结

Serpin与多种疾病密切相关，该家族成员的基因多态性在不考虑客观因素条件下在国内外尚未出现较为统一的结论，因此成为研究热点。目前，针对SerpinD1生物学特性及结构与功能的研究较多，但对相关临床应用的研究较少。未来，是否可以通过对SerpinD1的敲除、抑制或过表达来深入了解它的生物学功能，并分析其表达异常与疾病发生发展之间的关系，找出与SerpinD1相关的通路，进一步揭示疾病的分子发病机制，从而为临床诊断疾病和判断预后提供理论依据。