不同亚型巨噬细胞调控动脉粥样硬化转归的免疫学机制探析

陈 萍 陈文娜

1.辽宁中医药大学研究生学院(辽宁 沈阳 110032)；2.辽宁中医药大学医学检验学院(辽宁 沈阳 110032)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种慢性的血管炎症，主要的病理改变是血管内膜可见脂质沉积，同时伴有单核细胞及平滑肌细胞的大量增生，单核细胞吞噬脂质后形成泡沫细胞，随着脂质的不断沉积和结缔组织的大量增生，脂点、条纹逐渐融合成片，向内膜表面隆起形成粥样斑块，从而引起血管腔的狭窄。粥样斑块形成早期单核细胞迁移到血管内皮下层，分化为巨噬细胞，巨噬细胞在AS发病过程中发挥着重要作用，可通过调控血管炎症、脂质沉积等影响动脉粥样硬化的转归。

1 巨噬细胞的极化和可塑性

巨噬细胞的分型是根据其极化后所发挥的功能进行命名的，即以分泌促炎因子为主、发挥促炎活性的为M1型巨噬细胞；分泌抗炎因子、发挥抗炎及组织修复作用的细胞为M2型巨噬细胞[1]。干扰素-γ(interferon-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等可刺激巨噬细胞活化成为典型M1细胞。M1活化的标志物有白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α、IL-12、IL-23、CXCL9及CXCL10等。M1型巨噬细胞可以产生大量一氧化氮(NO)、活性氧等中间产物，参与肿瘤发生及抗寄生虫感染的免疫过程。M2型巨噬细胞由IL-4，IL-10和糖皮质激素刺激分化而成，Th2淋巴细胞产生的IL-4与巨噬细胞表面的IL-4R结合，激活下游的JAK1、JAK3细胞信号通路，最后激活STAT6，表达M2型细胞相关蛋白[2]。M2型巨噬细胞可产生大量IL-10及少量IL-12，参与组织重塑、血管发生和肿瘤发展等过程，同时作为免疫调节剂参与过敏反应。M2型巨噬细胞又分为4个亚型，分别为M2a，M2b，M2c，M2d。M2a的a代表“alternative”，M2a由IL-4、IL-13、免疫复合物、脂肪酸和Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂或IL-1R配体刺激分化而来，高表达甘露糖受体MR/CD206及FoxO1，分泌大量IL-10，其次是TNF-α，IL-6和IL-1。M2c型巨噬细胞由IL-10、TGF-β、糖皮质激素等刺激产生，高表达Mer受体激酶(Mer receptor kinase，MerTK)[3]，并能分泌大量IL-10来抑制促炎细胞因子、NO、活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的产生，抑制炎症发展。M2d型巨噬细胞由TLR激动剂刺激分化而来，TLR激动剂可刺激M2d型巨噬细胞上的腺嘌呤受体A2A受体。腺嘌呤信号通路可抑制TNF-α、IL-1和IFN-γ表达，并能促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-10的表达，从而发挥促血管生成作用[4]。啮齿动物的M2型巨噬细胞特异性标志物有FIZZ1(Found in inflammatory zone 1)、精氨酸酶(Arginase-1，Arg1)。其中M2d型巨噬细胞并不表达FIZZ1和MR。

2 巨噬细胞亚型与动脉粥样硬化病变

体外实验中由于刺激单一，所以产生的巨噬细胞亚型单一，但体内实验情况复杂，斑块中常常存在多个亚型的巨噬细胞，而且亚型的种类与其在斑块中的位置有关。人的动脉粥样硬化病变具有高度异质性，即根据环境等多种因素可刺激生成多种巨噬细胞亚型。目前，巨噬细胞产生不同亚型的机制及其在AS发生中的作用机制尚不明确。

研究显示CD68+MR+的巨噬细胞主要存在于IL-4水平较高、脂质水平较低的斑块区域。Boyle等人发现了一种新的巨噬细胞亚型，称为HA-mac。这种亚型巨噬细胞主要存在于粥样斑块的出血区域，高表达CD163，低表达人白细胞抗原DR。研究发现这种亚型的巨噬细胞具有抗动脉硬化的作用，其能清除血红蛋白，减少氧化压力。Mhem型巨噬细胞与HA-mac型巨噬细胞的功能相似，具有破坏红细胞的作用[5]。这种巨噬细胞能导致转录因子1(Transcription factor 1)磷酸化激活。转录因子1可增加血红素氧化酶(Heme oxygenase，HMOX-1)的表达，启动肝X受体α(Liver X receptorα)/ABCA1/脂蛋白-E(Apolipoprotein，ApoE)级联，从而起到抑制泡沫细胞形成的作用。粥样斑块中常常存在血管新生，导致红细胞渗漏至斑块中，从而增加斑块中的铁沉积。研究发现斑块中铁元素沉积部位往往聚集CD68+MR+型巨噬细胞，提示了M2型巨噬细胞在铁离子循环中的作用[6]。

研究发现除了M1型、M2型和血红蛋白相关的巨噬细胞亚型外，还存在啮齿动物特异性的巨噬细胞，如Mox型巨噬细胞。Mox型巨噬细胞由斑块中积累的被氧化的磷脂刺激而来。这种亚型高表达HMOX-1[7]。采用流式细胞技术对细胞分析结果显示低密度脂蛋白受体(Low-Density Lipoprotein(LDL)Receptor，LDLR)敲除的小鼠斑块中的巨噬细胞以M1型为主，占总巨噬细胞数的40%，其次是Mox型，占30%，M2型占20%，说明啮齿动物特异性的巨噬细胞是粥样斑块中巨噬细胞的重要组成部分。近来研究发现，人的粥样斑块中还存在M4型巨噬细胞，其能表达基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)7和钙绑定蛋白S100A8。此外，M4型巨噬细胞还表达MMP12，MR，以及一些促炎因子如IL-6，TNF-α。虽然M4型巨噬细胞是受CXCL4刺激极化而来，但是M4型巨噬细胞并不表达传统的CXCL4极化标志物血红蛋白-结合珠蛋白清除受体CD163[8]。

3 巨噬细胞亚型与AS发生

3.1巨噬细胞亚型与炎症相关 不同亚型巨噬细胞发挥不同的免疫效应，有的为促炎症作用，有的为抗炎症作用，这些不同表型的巨噬细胞都参与到AS的发生发展中。研究发现20周龄的ApoE敲除的小鼠给予低能量饮食，斑块病变中有巨噬细胞浸润，而且以Arg+M2亚型的巨噬细胞为主，随着疾病的发展M2型巨噬细胞转变为M1型。与此同时斑块中的细胞因子种类也发生变化，开始时以IL-4为主，随着病情的进展IFN-γ的表达增加，从而导致M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞。Arg2+M1型巨噬细胞具有促炎症作用，起到促进斑块形成的作用[9]。当给予ApoE敲除小鼠髙脂饮食10周后，M-CSF高表达可刺激巨噬细胞表达M2型标志物，如selenoprotein-1，CD163等。GM-CSF刺激产生的M1型相关基因血小板碱性蛋白(Proplatelet basic protein，PPBP)主要在病变早期表达，随着时间的延长，表达量降低。以上发现提示AS病变过程中GM-CSF和M-CSF的比例是改变的。以上说明小鼠AS病变中巨噬细胞的情况，因为小鼠巨噬细胞亚型与人类有所不同，所以研究人员以人为研究对象，发现AS过程中斑块中的M1和M2型巨噬细胞都显著增加[10]。为了研究巨噬细胞亚型与斑块的关系，研究人员比较了有症状的急性中风患者和无症状的急性中风患者的情况，结果显示M1型巨噬细胞存在于有症状的患者的斑块中，主要是不稳定斑块[11]。M1型巨噬细胞表面高表达SR(Scavenger receptor)受体，这些受体可以介导细胞吞噬变性的脂蛋白如oxLDL。虽然M2型巨噬细胞具有抗炎作用，但是它们在AS发生过程中的功能是不同的。M2a型巨噬细胞可抑制大量炎症因子如INF-γ、IL-1[12]释放，M2b和M2c主要起调节作用，能通过调节慢性炎症相关的多种因素来抑制M1型巨噬细胞产生，从而限制损伤进一步发展[13]。由于它们不合成细胞外基质以及趋化因子受体，所以M2b和M2c型巨噬细胞不具有组织修复的能力[14]。

3.2巨噬细胞亚型与脂质沉积相关 M2型巨噬细胞由于表达CD36、SR-A1等能增加脂质摄入的受体，所以易导致胆固醇的积累，过量积累的胆固醇激活LXR，导致ABCA1，ABCG1的大量表达，从而增加胆固醇的运出。当以上平衡被打破，如ABCA1，ABCG1表达缺失或活性降低，则导致脂质在M2型巨噬细胞中积累。过度积累的脂质将刺激M2型巨噬细胞转换为M1型巨噬细胞，从而增加促炎因子分泌，促进粥样斑块形成。

AS发病初期巨噬细胞大量摄取氧化低密度脂蛋白，减少胆固醇运出，导致胞质中大量脂化胆固醇沉积，从而形成泡沫细胞[15]。巨噬细胞通过SR如CD36、SR-A1、lectin样oxLDL受体1(lectin-like oxLDL receptor-1，LOX-1)等摄取oxLDL。酰基辅酶A、胆固醇酰基转移酶1(Acyl coenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT1)和中性胆固醇酯水解酶(Neutral cholesterl ester hydrolase，nCEH)参与胆固醇脂类的形成[16]。ATP结合槽转运体ABCA1，ABCG1将胆固醇运出巨噬细胞[17]。巨噬细胞吞噬脂质，大量脂质在细胞中积累，从而形成泡沫细胞。巨噬细胞中CD36，SR-A1，LOX-1介导脂质吞噬，ACAT1、nCEH催化巨噬细胞中的脂质形成胆固醇脂，ABCA1，ABCG1和SR-B1介导胆固醇运出细胞。

4 巨噬细胞亚型对AS的调节机制

目前，研究已发现多种调节巨噬细胞亚型的机制，如MicroRNAs(miRNAs)、转录因子、高密度脂蛋白(high-denstiy lipoprotein，HDL)、雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)及雷帕霉素靶点(mammalian/mechanistic target ofRAPA，mTOR)等。

4.1miRNAs调节 miRNAs是短的非编码RNA，一般在22个核苷酸左右，这些核苷酸序列是高度保守的。mRNA通过RNA聚合酶转录，之后通过RNA酶Drosha和DGCR8形成miRNA前体。miRNA前体从细胞核进入胞质中，与胞质中的RISC复合体结合，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA与与目标mRNAs结合，导致mRNAs降解或抑制其转录。miRNA在巨噬细胞分化和功能的调节中发挥重要作用[34]。研究发现人和啮齿动物的粥样斑块中都有miRNAs的表达[18,19]。其中研究最多最深入的是miR-155。研究发现miR-155在巨噬细胞中高表达。miR-155是一种由促炎作用的miRNAs，由TLR刺激表达，继而增加促炎症细胞因子的产生。此外miR-155通过抑制B细胞淋巴瘤-6蛋白(B-cell lymphoma-6 protein，BCL6)表达来增加CCL2和TNF-α表达，从而促进M1型巨噬细胞的活化[20]。miR-147是NF-κB信号通路的负反馈调节因子，有抑制NF-κB信号通路的作用，可降低炎症巨噬细胞的免疫反应。miR-21及miR-146a/b也具有调节巨噬细胞亚型的作用，通过降低促炎因子产生，增加抗炎因子IL-10水平来激活M2型巨噬细胞，从而抑制NF-κB信号通路活化[21]。Let-7e通过抑制TLR4信号通路来抑制M1型巨噬细胞产生，miR125b下调IFN调节因子4转录因子来减少M1型巨噬细胞活化[22]。

4.2转录因子 大量研究发现核受体和转录因子在调节巨噬细胞亚型上具有重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ具有增加M2型巨噬细胞的作用，PPARγ能增加M2型巨噬细胞表面标记物如MR、AMAC、IL-10的作用。体外实验中PPARγ在单核细胞分化初级阶段起促进极化的作用。小鼠实验表明PPARγ能促进巨噬细胞表达Arg1，而PPARα和PPARβ不能促进M2型巨噬细胞表面标记物的表达[23]。Kruppel样因子(Kruppel-like factor，KLF)4能增加Arg1表达，从而增加M2型巨噬细胞，其机制是通过抑制NFκB信号通路来减少促炎因子的表达，并激活STAT6信号通路来上调Arg1表达[24]。虽然KLF4和KLF6都能调节巨噬细胞亚型，但是目前无明确结果证明这两种转录因子能调节粥样斑块中巨噬细胞亚型。有研究发现LXRα能间接减少Arg1水平，从而抑制斑块形成[25]。虽然M2型巨噬细胞具有抗炎作用，但M2型巨噬细胞容易囤积过量脂质。在人类巨噬细胞中，LXRα在CD68+MR+的巨噬细胞中低表达，这种巨噬细胞因为不能使内吞的脂质外流，所以容易引起脂质的过量积累。研究发现在小鼠体内NR4R家族成员与巨噬细胞分型相关，但是缺少人类细胞结果[26]。此外，研究显示Nur77表达缺失的小鼠体内，巨噬细胞更易分化为具有促炎作用的M1型巨噬细胞。这是因为Nur77缺失可以导致IL-12，iNOS水平降低，TNF-α水平增加。

4.3HDLs HDLs具有抗动脉粥样硬化的作用，机制是HDL具有逆向转运胆固醇的作用。HDLs能将泡沫细胞的胆固醇转运走，也能将胆固醇酯通过胆固醇至转换蛋白形成富含甘油三酯的颗粒，从而形成乳糜粒残余物和低密度脂蛋白。此外，HDLs还具有抗炎活性，如防止单核细胞粘附于血管内皮细胞表面等。

4.4RAPA和mTOR信号通路 RAPA是一种由放线菌链霉素产生的大环三烯类抗生素，具有免疫抑制的作用。RAPA能通过mTOR信号通路抑制T细胞增殖。mTOR是单核细胞、巨噬细胞以及髓样树突细胞存活和增殖的重要调节因子。体外和体内实验都显示RAPA能特异性导致M2型巨噬细胞死亡，而对M1型巨噬细胞无影响[27]。进一步研究发现，RAPA能通过增加CCR7，IL-6等M1型标记物水平，减少M2性标记物如IL-10，CCL18，VEGF的表达来改变M1型和M2型巨噬细胞比例。同时，有研究发现，小鼠骨髓源性巨噬细胞具有高mTOR复合物(mTORC1)活性，mTORC1能通过调节Akt信号通路非依赖性PPARγ来抑制M2型巨噬细胞标记物表达[28]。当加入mTOR抑制剂RAPA则能消除mTORC1的这种作用。目前，RAPA和mTOR在巨噬细胞分型上作用的机制尚不明确，有待进一步研究。

5 结论

动脉粥样硬化的发病基础主要有两个，其一是胆固醇在血管壁中积累，其二是炎症发生。胆固醇通过多种方式沉积于巨噬细胞，形成泡沫细胞。泡沫细胞进一步分泌多种促炎细胞因子，促进粥样斑块形成。巨噬细胞亚型与高脂血症所致的动脉粥样硬化的关系复杂，动脉粥样硬化过程中多种因子参与调节巨噬细胞亚型，不同亚型巨噬细胞又通过不同机制如通过miRNA、转录因子等调控血管周围的炎症反应及脂质沉积等，从而影响动脉粥样硬化的转归。本研究对巨噬细胞亚型与动脉粥样硬化的相互作用进行深入探析，旨在揭示动脉粥样硬化的发病机制，从而为寻找更加有效的药物防治动脉粥样硬化性疾病提供新的思路。