HopQ与人CEACAM1相互作用的研究进展

马 凯，王 鸽，孙建兵，汪亚辉，刘宏斌，惠 玲

(1.宁夏医科大学研究生院,银川 750004； 2.解放军联勤保障部队第940医院普外科，兰州 730050；3.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，兰州 730050)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是可以长期定植在人胃上皮细胞的特异性微需氧、革兰阴性、螺旋形菌，被世界卫生组织明确列为对人类有致癌作用的原核生物，是引起胃炎、消化道溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤和胃癌的主要原因之一[1-2]。Hp能产生多种细胞毒素和毒力因子，部分Hp携带细胞毒素相关基因致病性岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag-PAI)。细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated gene A,CagA)基因是cag-PAI的一部分，由27～31个基因组成，编码的CagA蛋白作为Hp的重要毒力因子与多种疾病的发生、发展有关[3-4]。目前研究表明，Hp的外膜黏附蛋白Hp外膜蛋白(Helicobacter pylori outer membrane protein,Hop)Q在致癌蛋白CagA进入宿主细胞的过程中发挥着重要作用，而这一过程需要癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)的介导，CEACAM1具有复杂的生物学功能，在肿瘤的进展中起重要作用。现就HopQ与CEACAM1的特点及通过何种相互作用促进CagA移位到宿主细胞内的相关研究进行综述。

1 HopQ基本特征

1.1HopQ的发现与等位基因 Hop家族基因组含有约30个同源性Hop基因如BabA(HopS)、SabA(HopP)、 OipA(HopH)、AlpAB(HopB和HopC)等，编码细菌外膜蛋白。2000年，Alm等[5]发现，Hp omp27 编码一种新的Hp外膜蛋白，并将其命名为HopQ。HopQ被认为是参与细胞黏附的蛋白之一，并与细菌毒力有关。随后，Cao和Cover[6]对比Hp各菌株后发现，Hp HopQ 存在一对核苷酸序列高度相似的等位基因，HopQⅠ和HopQⅡ。这两个等位基因存在地区特异性，从亚洲国家(韩国、日本、泰国)患者胃组织中分离出来的Hp几乎都是HopQⅠ型[7]；在美国和哥伦比亚，虽然HopQⅠ型也占主导地位，但HopQⅠ基因的表达率明显低于亚洲国家，HopQⅡ阳性菌株较多[8-9]；在法国和意大利两者均高表达[10]；而在伊朗地区，以HopQⅡ为主，且阳性率高于以上地区[11-12]。不同地区Hp表达的差异导致不同地区的人感染后表现出不同的临床症状[13]。

1.2HopQ的生物学特征 Hp HopQ基因组可以频繁发生种内重组，但HopQⅠ和HopQⅡ这2个等位基因可以保持相对完整性，其在氨基酸组成上有70%的同源性，但这两个蛋白质具有不同的功能[6]。Loh等[14]对比了4株含HopQⅠ的菌株与野生型菌株发现，HopQⅠ对胃上皮细胞具有黏附作用，这种菌种差异可能与HopQⅠ促进CagA向宿主细胞转运的能力有关。Belogolova等[15]发现，HopQ是一种非cag-PAI 编码的Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,T4SS)辅助因子，HopQ的缺失降低了T4SS依赖的核因子κB活化、促分裂原活化的蛋白激酶信号转导的诱导以及白细胞介素-8在宿主细胞中的分泌，但不影响宿主细胞的运动性和附着细菌的数量。Busch等[16]研究表明，HopQ与免疫细胞直接接触不仅破坏了其激活能力，还破坏了迁移能力，进而调节宿主免疫，造成免疫逃逸。目前研究表明，HopQ不但参与细胞黏附，还与Hp的毒力有关。携带HopQⅠ、CagA+、vacA s1基因的Hp能增加患慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌的风险[5-6]。还有研究报道，HopQⅠ、CagA、CagE、vacA s1、babA2、opiA的共表达能引起胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤[10]。伊朗地区的研究表明，HopQⅡ与胃癌显著相关，而HopQⅠ与病变类型无明显相关性，但也仅限于此地区[11]。HopQ毒力的作用目前还不明确，需要进一步研究。

2 CEACAM1基本特征

2.1CEACAM1的结构 CEACAM1曾称为CD66a，是癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族的一员，是一种跨膜糖蛋白[17]。CEACAM1基因是其家族中最保守的，位于染色体19q13[18]，由9个外显子组成，根据剪接模式的不同可分成11个亚型，其中8个亚型的结构由1个细胞外N端IgV样结构域、0～3个IgC2样结构域、1个保守的跨膜区域、1个胞质内短链区域(CEACAM1-S)和长链区域(CEACAM1-L)组成。CEACAM1-L的胞质区含有免疫受体酪氨酸抑制基序，被磷酸化后可参与信号转导和蛋白质间的相互作用。CEACAM1-S虽缺乏磷酸化位点，但可直接与原肌球蛋白、钙调蛋白以及肌动蛋白相连[19]。在细胞中，CEACAM1-L与CEACAM1-S的比例可根据所受刺激和细胞功能而发生动态变化。另外3个亚型仅由胞外结构域组成，不含有胞内段和跨膜区结构域。CEACAM1广泛表达于上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞以及各种肿瘤细胞中。

2.2CEACAM1的生物学功能 CEACAM1是CEACAMs家族中组织分布最广泛的一个，具有复杂的生物学作用。CEACAM1存在2种形式：一种是以细胞外分泌的形式存在于体液中；另一种是以跨膜形式存在于细胞上。前者可作为肿瘤标志物对肿瘤进行筛查，后者主要以二聚体的形式通过嗜同种(CEACAM1-CEACAM1)或与CEACAM5发生嗜异种(CEACAM1-CEACAM5)作用而表达在靶细胞上。CEACAM1的生物学功能主要包括介导细胞间黏附、促进血管和淋巴管生成[20]、调控免疫[21]、参与肿瘤病理过程。CEACAM1还可以直接或间接参与细胞间信号转导，抑制淋巴细胞激活，在肿瘤细胞的发生、发展、复发以及转移过程中发挥重要作用。CEACAM1在不同肿瘤中的表达水平也不同，在一些肿瘤中表达下调，如肝癌、膀胱癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌；但在甲状腺癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌中表达上调。研究表明，CEACAM1在胃癌中高表达，提示其参与胃癌的发病过程[22]。CEACAM1作为一种新的肿瘤相关基因，在不同肿瘤中表现出抑癌或促癌作用，并且在肿瘤免疫细胞的调控中也发挥重要作用，其可能成为研究的新领域。

3 HopQ与CEACAM1的相互作用

3.1HopQ和CEACAM1结合机制 Hp毒力菌株携带1个cag-PAI，编码1个T4SS，类似于菌毛结构的蛋白复合物，其能够将效应蛋白CagA注入真核细胞[23-25]。CagA进入细胞后通过磷酸化或非磷酸化的方式调控胃上皮细胞[26]，主要包括抑制先天防御机制[27]、细胞极性和迁移变化[16,28]以及致癌事件[29-30]。而HopQ与CEACAM1的相互识别在这一过程中发挥重要作用。近年来，人们用Hp感染整合素敲除的胃上皮细胞发现，细胞表面的β1整合素异二聚体(α1β1、α2β1或α5β1)和任何其他αβ整合素异二聚体对CagA的易位都不是必需的[31-32]。相比之下，尽管敲除细菌整合素使Hp与胃上皮细胞的结合能力仅降低到50%，但是Hp中HopQ的缺失或同时敲除细胞中的受体CEACAMs家族蛋白则几乎不会发生CagA注射。这说明人胃上皮细胞上的细胞表面整合素与Cag-T4SS 介导的相互作用对CagA易位并不重要，但Hp与CEACAM受体的相互作用促进了Cag-T4SS易位[31]。Feige等[32]敲除整合素α5β1和整合素连接酶后得到相同的结果。Königer等[33]和Javaheri等[34]研究发现，HopQ蛋白是一种真正的Hp黏附素，HopQ作为Hp表面黏附蛋白可特异性作用于CEACAM家族蛋白，并且HopQ-CEACAM1的结合是依赖于蛋白质-蛋白质而非聚糖依赖性相互作用。HopQ结合人CEACAM1蛋白氨基端的IgV样结构域，从而使主要致病因子CagA易位到宿主细胞，这种结合具有非常高的亲和力。研究HopQ的结构发现，HopQ的外域采用3+4螺旋拓扑结构，其中反向的β发夹结构(HopQ-ID)对癌胚抗原相关黏附蛋白的结合非常重要，去除β发夹导致其与HopQ-CEACAM1的结合亲和力降低约90%[33]。从这个区域衍生的竞争性肽链能抑制HopQ介导的CagA毒力途径的激活，如基因或抗体介导的沉默HopQ功能所示[34]。这一发现表明，HopQ-CEACAM1的相互作用是一个潜在的治疗Hp相关疾病的新靶点。

进一步研究发现，CEACAM1通过N端IgV域的相互作用与其自身或其他CEACAMs形成同二聚体或异二聚体[35]。从HopQ-CEACAM1晶体结构来看，HopQ利用CEACAM1的二聚体表面结合CEACAM1，从而阻止CEACAM1的二聚化，HopQ使用一种耦合的折叠结合机制结合识别CEACAM1的二聚界面[35]。它们之间的结合是蛋白质-蛋白质结合，其他形式的结合效果不是很显著，但也起到一定的作用，如糖基化，这一点与之前的研究不一致[33]。为了更详细地了解CEACAM1二聚体和HopQ-CEACAM1复合物界面结合能的分布[35]，对结合界面两侧进行一次全面的丙氨酸诱变扫描分析，结果未发现明显的能量热点，仅观察到结合减少了30%～50%，这表明结合能量分散在许多残基上。HopQ-CEACAM1复合物形成后，总共有2 020 Å2的表面积被掩埋，较CEACAM1同二聚体多400 Å2[36]。HopQ外侧域中有四个环与CEACAM1分子接触：α3-β1环(残基102-111)、β2-α4环(残基134-161)、α5-α6环(残基240-244)、α7-α8环(残基363-385)，其中β2-α4环占据了HopQ-CEACAM1复合物接触表面积的60%左右，β2-α4环的β发卡序列通过主链氢键与CEACAM1残基95-97连接。CEACAM1与HopQ的β2-α4环之间形成的氢键大部分来自主链原子，14个氢键中只有6个来自侧链原子。β2-α4环的小α螺旋和环上其他残基伴随着β发卡通过CEACAM1 N端的IgV形成类似β拉链结构的表面，并在两者之间形成广泛的范德华力和氢键。α7-α8环的作用方式与β2-α4相同，只是作用范围及作用力较前者小，其余两个HopQ环与CEACAM1形成相互作用是最小的[35,37]。

3.2HopQ亚型和CEACAM1二聚体的顺、反式结构对结合的影响 为探索HopQ亚型与CEACAM1的关系，Moonens等[37]比较了HopQⅠ和HopQⅡ与CEACAM1接触面的三维结构，结果在CEACAM1中未观察到明显的构象变化；而Ⅰ型和Ⅱ型HopQ比较发现结合界面区域发生了显著变化，其中包括接触面残基数变化、氨基酸的替换以及氢键变化等，这些变化导致HopQⅡ-CEACAM1络合物与HopQⅠ-CEACAM1络合物相比总共损失了7个氢键，但亲和力高出大约6倍。说明HopQⅡ具有更强的黏附能力。

不仅HopQ亚型影响结合，CEACAM1二聚体的顺、反式结构也影响结合。为验证CEACAM1制剂的寡聚状态，研究者对可溶性的CEACAM1进行了X射线小角散射测量。将实验散射数据与单体、顺式或反式二聚体CEACAM1的理论散射曲线进行比较发现，CEACAM1的N-结构域是以反式二聚体的形式存在的，与晶体HopQ-CEACAM1配合物一致，两种蛋白质的溶液散射曲线显示它们以1∶1的化学计量配合物存在，说明CEACAM1在溶液中作为反式二聚体存在[38]，并且在HopQ的存在下，CEACAM1二聚体丢失有利于HopQ-CEACAM1复合物的形成[37-38]。以上发现表明，CEACAM1反式二聚体与单体形式快速平衡，或者HopQ可以在其结合过程中破坏CEACAM1反式二聚体。之后的细胞实验得到相同的结果[37]。综上表明，HopQ依赖性黏附诱导宿主CEACAM1的二聚体到单体转化。

4 HopQ-CEACAM1复合物对CagA易位的影响

Hp细胞毒素CagA易位到宿主细胞是细菌感染的标志，也是包括胃癌在内的严重胃病的主要危险因素。慢性感染时，CEACAM1的表达上调，Hp通过促进受体细胞形成足够的受体丰度发挥作用[34]。近年来，一些CEACAMs作为Hp外膜黏附素HopQ的受体，参与CagA宿主细胞的注射过程。Hp结合诱导CEACAM1介导的信号转导，HopQ-CEACAM1相互作用促进了毒力因子CagA通过Cag-T4SS易位进入宿主细胞，并增强促炎症介质(如白细胞介素-8)的释放[15,39]。然而，研究表明这可能不是一种信号转导现象，因为具有不同细胞质信号转导结构域的几个CEACAMs允许CagA易位，并且HopQ无已知的信号转导特性，这可能主要是由于HopQ-CEACAMs相互作用的相对高度的亲合性造成的[35]。HopQ-CEACAM1相互作用在半纳米级范围内为CagA的转运提供了足够的“停留时间”。虽然目前研究已经全面描述了HopQ-CEACAM1相互作用的分子基础，但这些相互作用触发或允许CagA易位的机制目前尚不清楚。HopQ-CEACAM1相互作用有助于Hp的胃定植或诱导病理改变，但这种相互作用在体内的确切作用和功能后果仍有待确定。

5 小 结

Hp特异性地定植于人胃上皮细胞，是引起溃疡病和胃癌的主要原因，其致病机制非常复杂。HopQ作为Hp的黏附蛋白，也具有一定的毒力作用。CEACAM1作为HopQ的蛋白质受体，在Hp感染过程中发挥重要作用，HopQ可以诱导反式二聚化的CEACAM1解聚，然后以1∶1单体的形式相结合，HopQⅡ 对CEACAM1的亲和力是明显大于HopQⅠ。它们之间的结合促进了致癌蛋白CagA向宿主细胞的易位，但易位的具体分子机制目前还不清楚，有待进一步探索。

Hp的黏附和CagA的易位有可能成为疾病治疗的靶点，其抑制剂可以在多个水平上作为抗癌剂(即作为抗黏合剂和抗肿瘤蛋白易位剂)。研究发现，人工合成的CEACAM1抑制剂较野生型细胞表面表达的CEACAM1具有更高的亲和力和特异性结合HopQ[35]。此外，如果将它们与抗微生物剂相结合，这种高亲和力的CEACAM1抑制剂可以起到窄谱抗生素的作用以杀死Hp，同时减轻对肠道微生物群中共生细菌的损害。