中性粒细胞产生活性氧在肿瘤发生发展中作用的研究进展

于 涛，范 婉综述，梁飞新审校

0 引 言

大量研究发现，活性氧与肿瘤的发生发展存在着密切关系。细胞正常的生理代谢是活性氧的胞内来源，外源性活性氧则主要由物理、化学和生物因素刺激生成。慢性炎症刺激是促进肿瘤发生发展的重要因素，据肿瘤流行病学资料显示，各型肿瘤中约10%～20%是由炎症引起的［1］。肿瘤微环境是一个动态的网络，除了包含肿瘤细胞外，还包括中性粒细胞等炎症性细胞。肿瘤细胞可分泌细胞因子，趋化中性粒细胞至肿瘤部位。研究表明，肿瘤及周围组织中高水平的中性粒细胞浸润与不良预后关系密切［2］。在肿瘤微环境内，中性粒细胞可以产生活性氧和多种细胞因子，参与肿瘤的进展和破坏等进程［3-4］。其中，活性氧可以氧化DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物等，从而调节包括肿瘤形成在内的多种氧化还原介导的病理过程［5］。其作用具有双重性，一方面，低浓度活性氧产生基因毒性效应，促进肿瘤形成发展；另一方面，高浓度活性氧又发挥细胞毒性作用诱导肿瘤消退。鉴于肿瘤微环境内中性粒细胞活化、活性氧的产生与肿瘤发生发展之间的紧密关系，深入研究中性粒细胞内活性氧对肿瘤的双向机制，可能会为干预肿瘤形成和发展提供新的启示。

1 中性粒细胞内活性氧的产生及清除

中性粒细胞也称多形核白细胞，是固有免疫系统的重要组成部分，来自于骨髓中的造血干细胞，在骨髓中分化发育后，进入血液或组织内，是外周血白细胞中最为丰富的细胞［6-8］。一旦病原体入侵，中性粒细胞会在趋化因子的作用下聚集于感染部位，通过吞噬、脱颗粒等作用杀灭病原体［9］。在此过程中，发生剧烈的反应，快速大量释放活性氧，同时伴有耗氧量激增，这一现象称为呼吸爆发，由NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）催化此反应进程［6，8］。Nox是细胞内通过将电子从NADPH传递给分子氧，产生O2-·，并激发产生一系列活性氧的一类重要酶。其中Nox2是NADPH氧化酶的原型，在吞噬细胞中高表达，定位于细胞膜磷脂双分子层内，是免疫细胞杀伤入侵病原体的重要武器之一。gp91phox和 p22phox是此酶的催化亚基，p67phox，p47phox和p40phox是此酶的调节亚基［5，10］。Nox在细胞处于静息状态时没有活性，中性粒细胞被激活后，触发细胞膜内的Nox以催化产生大量的活性氧，其中包括羟自由基（hydroxyl radical，·HO）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）、单线态氧（singlet oxygen，1O2）、次氯酸（HOCL）和 超 氧 阴 离 子（superoxide anion，等［1］。

在正常生理情况下，机体内存在一套完善的氧化-抗氧化平衡体系，活性氧不断地产生和清除维持了此动态平衡，参与机体内活性氧清除的物质主要有两类：一类为抗氧化酶，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），过氧化氢酶（cata⁃lase，CAT），谷胱甘肽过氧化氢酶（glutathione perox⁃idase，GSH-Px）等；另一类为小分子抗氧化剂，包括维生素A、维生素C、辅酶Q等［11］。然而，抗氧化防御系统并不总能彻底清除新产生的活性氧，这将会导致活性氧过剩从而引起氧化应激，造成邻近组织的氧化性损伤［8-9］。氧化应激会引起细胞内氧化还原状态和蛋白质结构功能的改变，并与多种疾病相关，包括慢性炎症、心血管疾病、老年疾病、肿瘤、衰老等［12-13］。

2 中性粒细胞内活性氧的促肿瘤作用

正常细胞在一定致癌因素的作用下，基因发生突变，导致其异常增生，进而转化为肿瘤细胞。此过程需要历经启动，促进和进展3个阶段。在肿瘤形成的这3个阶段中，都有活性氧的参与。中性粒细胞内分泌产生的活性氧在促进肿瘤的发生发展方面起着诸多作用，包括引起DNA损伤、基因突变、活化致癌物质、诱导脂质过氧化和调控多种肿瘤细胞信号传导通路等。

2.1 DNA损伤中性粒细胞可以通过活性氧依赖性机制激活芳香胺、黄曲霉毒素、雌激素、酚类和多环芳烃等致癌物质引起DNA损伤［14］。Wilson等［15］在研究中发现，中性粒细胞内释放的活性氧可损伤肝端粒DNA，进而导致肝癌发生。诸多研究显示，激活的中性粒细胞释放产生的活性氧能引起DNA的氧化性损伤，包括双链或单链的断裂，姐妹染色单体互换，基因突变等一系列生物学结果［16］，这可能使机体某些分化中的细胞生长分裂失控，细胞无限增殖，进而导致肿瘤的发生发展。相似地，Gungor等［17］研究表明中性粒细胞内髓过氧化物酶（myelo⁃peroxidase，MPO）可催化 H2O2与 Cl-反应生成化学活性很强、可杀灭微生物和病原体的HOCL，导致DNA损伤和点突变。HOCL可使脂质过氧化产生丙二醛。丙二醛能够与核酸碱基相互作用形成环外DNA加合物，主要是M1dG，M1dG加合物在哺乳动物细胞中具有促进突变作用并诱导基因移码突变和碱基对替换的作用［18］。

2.2 诱发染色体不稳定朱茂祥等［19］用化学发光法对体外产生和模拟体内炎症情况下（PMA刺激中性粒细胞）产生的活性氧进行鉴定，研究其诱发11号染色体基因突变规律的结果表明，·HO诱发基因突变的能力明显高于H2O2。·HO诱发11号染色体基因突变的特征以CAT基因缺失为主，而H2O2主要造成APO21基因突变，这两种基因的表达产物都是体内重要的抗氧化酶或蛋白，提示活性氧的损伤作用可能通过影响抗氧化基因的表达而使体内抗氧化能力降低。

2.3 调控癌基因目前发现，中性粒细胞内产生的活性氧可诱导胞嘧啶脱氨酶的异位表达，这与p53的突变及促进肿瘤的发生有关［20］。p53是一种转录因子，与肿瘤关系密切。其可诱导细胞周期阻滞、DNA修复和诱导细胞凋亡等。p53基因突变后，其下游蛋白p21对多种cyclin-CDK复合物抑制能力降低，从而失去了对细胞生长、凋亡的调控作用。

2.4 诱导脂质过氧化生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸因含多个双键而化学性质活跃。中性粒细胞内产生的活性氧可诱导附近细胞的细胞膜中多不饱和脂肪酸的脂质过氧化，产生反应性醛，其中包括4-羟基壬烯醛（hydroxynonenal，HNE），丙二醛和丙烯醛，从而导致膜通透性和流动性增加，细胞质外流和膜蛋白活性丧失。脂质衍生的反应性醛比活性氧更加稳定，可以扩散到比活性氧更远的位置并介导肿瘤的形成发展［5］。除丙二醛可形成M1dG诱导基因突变外，HNE也可调控多种转录因子，促进肿瘤生长［18］。

2.5 参与肿瘤的侵袭和转移近年来越来越多的证据表明，中性粒细胞内释放的活性氧与肿瘤的不良预后关系密切。有报道指出，高转移性的肿瘤细胞IL-8的表达升高，IL-8可诱导中性粒细胞的激活和趋化，并促进其产生活性氧，由肿瘤相关中性粒细胞产生的活性氧增强了NF-κB的活化，从而增加了肿瘤细胞存活，生长和向转移表型发展的可能性。肿瘤微环境内，活性氧通过转化生长因子β活化蛋白激酶1（TGF-β activated kinase 1，TAK1）和转化生长因子β活化蛋白激酶2（TGF-β activated ki⁃nase 2，TAK2）等激酶激活 IκB 激酶（I-κB kinase，IKK），IKK可使细胞内抑制性亚基I-κB磷酸化，磷酸化I-κB然后通过泛素-蛋白酶体途径（ubiquitinproteasome pathway，UPP）降解并从NF-κB/I-κB复合物中脱落，从而使NF-κB活化入核，结合至靶基因的启动子区域启动基因表达以促进肿瘤细胞的生长与转移［21］。

Klink等［22］研究证明，与对照组相比，卵巢癌细胞与中性粒细胞的体外共培养会产生大量的活性氧，进一步研究显示，中性粒细胞活化水平的提高和活性氧分泌的增加是因为与卵巢癌细胞直接的接触所致，同时，中性粒细胞上CD11b/CD18黏附因子表达的上调，从而增强了其黏附能力，这成为了中性粒细胞产生的活性氧参与促进肿瘤细胞转移的有力证据。此外，中性粒细胞线粒体内活性氧升高可以导致中性粒细胞外捕获网（neutrophil extracl⁃lular traps，NETs）的释放［23］，而NETs中多种组分又参与肿瘤细胞的增殖、转移、肿瘤相关性血栓形成［24-26］，这提示细胞间活性氧信号传导和NETs之间的协调作用可能在中性粒细胞介导的肿瘤细胞形成发展中起重要作用。

3 中性粒细胞内活性氧的抗肿瘤作用

有学者发现在肿瘤发展的早期阶段，中性粒细胞会大量分泌NO2、H2O2、TNF-α，这对肿瘤细胞具有很强的细胞毒性［27］。也就是说，大量的活性氧在肿瘤发生发展进程中可起抗瘤作用。许多研究已证实通过刺激中性粒细胞产生活性氧可以介导肿瘤细胞的非特异性裂解，因此，活性氧已被认定为在中性粒细胞内氧依赖性杀伤肿瘤细胞机制中的效应分子［5］。

3.1 诱导肿瘤细胞凋亡中性粒细胞产生的活性氧在诱导肿瘤细胞凋亡中起到关键作用，但其作用机制目前尚不完全明确。研究人员发现，经PMA激活后的中性粒细胞释放的H2O2可以有效地杀伤P388、TLX9淋巴瘤细胞和4T1小鼠乳腺癌细胞。同时，来自患有髓MPO缺乏症或H2O2产生缺陷的患者，其中性粒细胞对肿瘤细胞也不存在细胞毒性［28］。Yan 等［29］为了研究中性粒细胞杀死肿瘤细胞的相关机制，将添加了CAT的中性粒细胞后与肺癌A549细胞的共培养后发现，中性粒细胞诱导的A549肺癌细胞杀伤的能力降低，这表明中性粒细胞产生的H2O2对肺癌的免疫应答至关重要。在活性氧的生成过程中，超氧化物歧化酶（SOD）能催化转化H2O2，然后在过渡金属离子（Fe2+、Cu+）介导的Haber-Weiss反应中生成·HO，·HO是最活跃的活性氧，可攻击DNA，引起DNA双链断裂、氧化、突变，从而引起肿瘤细胞的凋亡和坏死。Chen等［30］发现食管癌细胞产生的IL-17可上调CXC趋化因子如CXCL2，CXCL3的表达，从而趋化中性粒细胞至食管癌微环境中并促进MPO的分泌；MPO可催化激活中性粒细胞内Nox将O2-·歧化为H2O2，之后H2O2与Cl-和H+作用产生HOCL，诱导肿瘤细胞的凋亡。低浓度的HOCL并不直接影响细胞；但在高浓度下，它可以通过其细胞毒性作用修饰生物分子［5］。

同时最新研究表明，放射诱导后的中性粒细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。Takeshimaa等［31］发现，在肿瘤微环境中，放射诱导的中性粒细胞（RT-recruited tumor-associated neutrophils，RTNs）会产生更大量的活性氧并攻击肿瘤细胞，且与G-CSF结合后会增强RT-Ns诱导肿瘤细胞凋亡的能力。该研究还发现G-CSF刺激RT-Ns产生的活性氧可参与肿瘤特异性T细胞（cytotoxic T lympho⁃cytes，CTLs）的激活并可能增强CTLs介导的抗肿瘤免疫应答能力。

3.2 减少肿瘤细胞增殖及转移在肿瘤微环境中，活化的中性粒细胞大量产生活性氧抑制肿瘤细胞的增殖，其可能的机制为在肿瘤发展的早期阶段，通过抑制Nrf2/ARE信号从而影响NF-κB信号通路传导，抑制肿瘤细胞的增殖发展［5］。另外，活性氧诱导脂质过氧化生成的HNE与人体HL-60白血病细胞培养表明，在细胞周期中，HNE的活性受到细胞周期蛋白尤其是细胞周期蛋白D2、D1和A的抑制，减少了细胞在G0/G1期的增殖。HNE还能通过上调抑癌基因p53、p21和促凋亡基因Bax的表达，在肿瘤防治中起作用［32］。Granot等［33］研究发现，在肿瘤发生发展过程中，机体会产生独特的细胞毒性中性粒细胞群，这些中性粒细胞被原发性肿瘤夹带至远处组织，并产生H2O2，由此发挥其细胞毒性作用，降低肿瘤细胞的远处转移。

4 结 语

大量临床研究证实，中性粒细胞数量的与肿瘤的血管生成、淋巴结转移、分期、不良预后呈正相关［2，34-35］。同时，在术前及术后子宫内膜癌、肝癌患者体内中性粒细胞与淋巴细胞的比值研究表明：中性粒细胞与淋巴细胞的比值越高，癌症复发率就越高［36-38］。鉴于中性粒细胞及其产生的活性氧在肿瘤发生发展中所展现的重要作用，靶向肿瘤微环境内中性粒细胞产生的活性氧有望成为一种新的肿瘤治疗手段。近年来，Blache等［39］提出以鼠伤寒沙门菌（salmonella typhimurium，ST）作为载体，携带可特异性识别肿瘤IDO的shRNA的一种新的靶向性治疗癌症的方法，简称为shIDO-ST，他们在shIDO-ST治疗黑素瘤的临床试验中观察到，肿瘤细胞内IDO沉默，中性粒细胞在瘤内聚集并产生大量活性氧以及肿瘤细胞的凋亡，该实验提示，中性粒细胞产生的活性氧可能在肿瘤微环境内产生氧化应激并诱导肿瘤细胞的凋亡。虽然shIDO-ST杀伤肿瘤细胞的机制未明，但这项研究至少为进一步探索中性粒细胞内产生的活性氧在肿瘤防治领域中的角色提供了新的思路。

中性粒细胞作为固有免疫系统的重要组成部分，本身就具备肿瘤免疫监视作用和很强的肿瘤抑制能力，因此与其他来源的活性氧相比，中性粒细胞内产生的活性氧在肿瘤防治领域应该具有更好的研究及应用前景。但我们也注意到，中性粒细胞可产生的不同浓度及种类的活性氧，其对肿瘤细胞所发挥的究竟是促进还是抑制作用尚无统一定论。因此，进一步深入研究不同种类及浓度的活性氧对肿瘤细胞的生物学特性、分子机制和治疗作用，或将成为靶向中性粒细胞内活性氧参与肿瘤预防和治疗的关键。