细胞自噬在骨髓增生异常综合征发病机制中的作用

王冬琴，许 鸣，陆嘉惠※

(1.上海中医药大学附属市中医医院血液科，上海 200071； 2.桐乡市第一人民医院中医科，浙江 桐乡 314500)

细胞自噬是细胞将胞内受损、变性或衰老的蛋白质及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程，其水平变化与感染、衰老、神经退行性疾病、代谢疾病和肿瘤等生命过程密切相关。根据底物运送到溶酶体腔方式的不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬3种，其中巨自噬是目前研究最广泛的一种自噬形式。在正常情况下，自噬为细胞提供能量，有利于细胞保持自我稳态，是程序性细胞死亡的形式之一。在发生应激时，自噬主要通过维持基因组完整性和预防增殖及炎症发挥细胞防御机制，细胞主要表现为自噬水平升高以防止有毒或致癌的损伤蛋白质和细胞器累积及抑制细胞死亡[1]。然而在肿瘤发生发展过程中，自噬不仅可以产生保护性作用，为癌细胞提供更丰富的营养以维持细胞生长和增殖，还可以诱导癌细胞凋亡[2]。骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是起源于造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的一组高度异质性克隆性疾病，以一系或多系血细胞病态造血及无效造血、高风险向急性白血病转化为特征。MDS的发病机制至今仍不明确。研究表明，HSC的自噬缺陷可导致受损线粒体的堆积、代谢产物(活性氧类)增多造成细胞损伤及基因不稳定，最终诱导具有MDS表型的细胞增殖，甚至进展为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[3]。现就细胞自噬在MDS发病机制中的作用予以综述。

1 自噬缺陷与MDS

1.1线粒体自噬缺陷导致红系成熟障碍 作为细胞内的重要细胞器，线粒体在真核生物细胞的生长、增殖分化和死亡等生命活动中发挥十分重要的调控作用。线粒体损伤是许多人类疾病的直接诱因，而线粒体自噬是细胞清除受损、功能失调和终末分化过程中线粒体的过程，也是细胞维持自身稳态的一种重要调节机制。细胞出现自噬缺陷，可引起损伤和老化线粒体的大量聚集及细胞分化后期线粒体清除不足，从而促进肿瘤的发展。有文献报道，线粒体缺陷和红细胞成熟障碍是低危MDS难治性贫血的重要特征，功能缺陷的线粒体又能够诱导活性氧类水平升高导致DNA损伤，使细胞癌变或异常增殖，从而引起白血病[4-5]。Houwerzijl等[6]的研究表明，MDS中低危患者红系分化的早期阶段，幼红细胞较正常细胞具有更强的自噬特征，增强的自噬可能是一种细胞保护机制，可以去除有缺陷的含铁线粒体，防止自噬底物的增加对细胞造成进一步的损伤，从而造成高风险MDS的发生。此外，中高危MDS贫血患者骨髓单个核细胞内异常线粒体高度累积，其外膜蛋白Nix介导的线粒体自噬功能缺陷使得红细胞无法去除多余线粒体形成双凹面的成熟红细胞[7-8]。Sandoval等[9]在Nix敲除(Nix-/-)贫血小鼠模型中发现受损线粒体无法进入自噬体的现象。

1.2Beclin-1依赖性自噬减少抑制骨髓单个核细胞死亡 酵母自噬相关基因的哺乳动物同系物Beclin-1是第一种被发现的抑制肿瘤的自噬基因。虽然中低危MDS患者的骨髓CD34+细胞异常增生并出现病态造血，但这类细胞仍具有一定正常功能，可通过自噬水平的升高将受损的细胞器、DNA降解后重新利用。有文献报道，中低危MDS患者骨髓单个核细胞中的Beclin-1信使RNA和蛋白表达水平显著高于非肿瘤血液病患者，高危MDS患者及AML患者骨髓单个核细胞中的Beclin-1水平明显低于中低危MDS患者和正常人，提示Beclin-1依赖性自噬减少为MDS的发病和进展机制之一[10]。Pattingre等[11]对在哺乳动物和酵母中过表达抗凋亡蛋白Bcl-2进行研究发现，Bcl-2减少了Beclin-1的表达，相反突变型Bcl-2不能减少Beclin-1的表达，表明Beclin-1依赖性自噬受Bcl-2抑制。另外有研究显示，骨髓单个核细胞中Bcl-2的表达随着MDS危度上升而增加，故推测MDS中高表达的Bcl-2可能抑制Beclin-1依赖性自噬导致细胞凋亡减少[12]。

1.3自噬缺陷增加MDS向急性白血病转化的风险 高危MDS患者骨髓单个核细胞内低度的自噬活性使得细胞无法及时清除自身代谢产生的活性氧类，从而进一步造成DNA损伤。Goncalves等[13]对40例MDS患者和10名正常人骨髓单个核细胞中的活性氧类水平与DNA损伤进行相关性分析发现，MDS患者中导致高水平活性氧类产生的CYBA、谷胱甘肽过氧化物酶1和超氧化物歧化酶2基因表达增加，且高水平的活性氧类与修复DNA损伤的NEIL1(nei like DNA glycosylase 1)和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶基因突变呈正相关，而NEIL1和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的突变是MDS向AML转化的关键。同时，高水平的活性氧类还能抑制负性调控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1自噬通路的肿瘤抑制因子人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的活性，从而抑制其激活Ⅰ类磷脂酰肌醇-3-激酶促进自噬或促进其活化蛋白激酶B抑制自噬。有研究显示，难治性贫血伴原始细胞过多MDS患者骨髓单个核细胞的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因蛋白表达水平显著低于难治性血细胞减少伴多系病态造血MDS患者，而高危MDS患者骨髓及外周血单个核细胞中的原癌基因产物蛋白激酶B水平较低危MDS患者显著升高，其原因可能为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的缺失[14]。

2 细胞自噬与MDS发生

MDS的发病机制涉及HSC、骨髓微环境和基因表达异常，这3种致病机制可相互影响，促进MDS的发生、发展，给MDS的病因诊断增加更多阻碍。异常的自噬除影响HSC外，还可通过影响骨髓微环境或被表观遗传所调控参与或影响MDS的发生、发展。

2.1自噬与HSC稳态

2.1.1自噬调控HSC静息态 MDS是HSC克隆性疾病。在正常状态下，大部分HSC处于静息状态，仅有极少的HSC分化成各系成熟的血细胞，而静息态的HSC储备可防止细胞过度增殖导致白血病细胞生成、干细胞衰竭和造血谱系不能再生。HSC进入静息状态通常与代谢变化相关，与增殖细胞需要更多的代谢用于生物合成相比，静息态HSC主要依靠糖酵解而非线粒体氧化磷酸化供能维持细胞基础代谢，以缓解骨髓大量的代谢需求和避免过度活性氧类积累从而维持细胞稳态，因此其胞内线粒体水平极低。因自噬参与静息态HSC清除多余线粒体和降解受损细胞器及蛋白质等代谢废物的循环利用过程，故其水平通常会随年龄的增长而降低。Gomez-Puerto等[3]的研究证实，静息态HSC中的自噬通量明显高于分裂期细胞。此外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白是抑制自噬的受体蛋白和HSC自我更新的重要调节因子，其过度活化会使HSC内的活性氧类水平上升从而破坏HSC的静息状态，使HSC过早衰竭，但用抗氧化剂和自噬激活剂雷帕霉素处理HSC能抑制胞内活性氧类水平升高和过度活化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号，进而促进HSC体外扩增及造血重建[15]。

2.1.2自噬调控HSC增殖分化 MDS存在HSC增殖分化异常，在HSC的增殖和分化过程中涉及诸多调控因素，干细胞基因程序性表达、细胞因子和造血微环境等均能影响HSC的定向分化。自噬是细胞体内平衡和重构必需的代谢过程，研究表明其广泛参与HSC增殖分化过程[16]。Gomez-Puerto等[3]发现，选择性敲除小鼠HSC自噬相关基因(autophagy-related gene，ATG)5或ATG7能够导致细胞周期缩短、细胞凋亡和细胞活性氧类水平升高，且过度的活性氧类可损伤DNA进而诱导HSC异常增殖分化，丧失正常的造血能力，出现严重的髓性增生甚至具有AML表型的HSC。GATA-1作为HSC向红系分化过程中的关键转录因子，能与叉头框蛋白O3A一起调控自噬相关基因表达及溶酶体合成，其与自噬基因的表达随着红系分化逐渐增加，在红细胞成熟后期线粒体的清除中发挥重要作用。此外，Cao等[17]发现自噬的丧失导致HSC线粒体和细胞周期功能障碍，从而阻碍巨核细胞生成和分化，最终产生异常的血小板。同时，Huang等[18]也发现ATG9B、SHC1是HSC向单核细胞和粒细胞增殖分化过程中的重要调节因子。

2.2自噬与骨髓造血微环境

2.2.1自噬调控骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)的增殖分化和凋亡 BMSC是骨髓微环境的关键成分之一，对HSC不仅有机械支持作用，还具有分泌多种生长因子(白细胞介素-6、白细胞介素-11及巨噬细胞集落刺激因子等)精细调控HSC以使其保持终身造血的能力。与成骨细胞相比，BMSC有更强的自噬特征，而与处于增殖阶段的BMSC相比，处于分化阶段的BMSC自噬水平会进一步升高，高水平的自噬可以降低细胞分化期间由糖酵解供能转换为线粒体代谢所升高的活性氧类水平，防止其过度积累造成BMSC损伤[19]。同时，保持较高水平的自噬也可以防止BMSC 在骨髓缺氧环境下过度凋亡[20]，这与Liu等[21]模拟骨髓低氧条件并用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理小鼠BMSC的实验结果一致。另外，使用3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素分别处理年轻人和老年人的BMSC后发现，其成骨分化和增殖能力分别有相应程度的抑制和促进，表明自噬在BMSC衰老中也发挥重要作用[22]。目前，虽没有直接证据表明MDS患者与正常人的BMSC自噬水平有差别，但自噬能够调控BMSC的增殖分化、衰老和凋亡，故其水平变化必然会改变BMSC的功能，从而导致MDS的发生。

2.2.2自噬调控转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的促凋亡效应 TGF-β参与调控细胞的生长、分化、凋亡和自噬。Geyh等[23]发现，TGF-βⅠ受体激酶的抑制剂能够消除TGF-β对BMSC功能的抑制，同时暴露于TGF-β后，正常人的BMSC可出现与MDS和AML患者来源BMSC表型相似的功能缺陷，故认为TGF-β是引发MDS和AML的最可能的外在触发因子。Suzuki等[24]发现，TGF-β与自噬之间有双向调控作用，其不仅能通过Smad和c-Jun氨基端激酶途径诱导ATG5、ATG7和Beclin-1表达促进自噬；另外，沉默自噬基因的表达也可以抑制TGF-β的生长抑制功能和下调其介导的促凋亡调节蛋白Bim的表达。同时有研究表明，MDS患者的Bim表达显著减少[25]，推测MDS骨髓单个核细胞中较低的自噬水平可能抑制骨髓环境中高表达的TGF-β的促凋亡效应。

2.3自噬与表观遗传学

2.3.1组蛋白修饰调控自噬 组蛋白H3/H4的甲基化和乙酰化修饰被认为是MDS发病的重要表观遗传学机制。自噬过程包括转录和表观遗传程序，因此自噬和组蛋白功能的异常与MDS发病密切相关。由于DNA甲基化变化具有潜在的可逆性，故阿扎胞苷和地西他滨等DNA去甲基化和组蛋白干预药物在MDS治疗中的应用也逐渐增多。现有文献报道，使用阿扎胞苷或地西他滨处理MDS细胞系SKM-1后细胞表现出更强的自噬特征[26]。启动子区高水平的组蛋白H3赖氨酸4三甲基化可导致MDS患者骨髓CD34+细胞中大量转录因子尤其是核因子κB的异常表达。核因子κB是一种抗凋亡蛋白，Fabre等[27]使用核因子κB抑制剂BAY11-7082处理MDS骨髓细胞后，在细胞核凋亡之前观察到细胞质中存在许多自噬泡。同时陆嘉惠等[28]进一步研究发现，低危组MDS细胞中核因子κB活化水平下降，凋亡增加，高危组MDS细胞中核因子κB活化水平升高，凋亡减少。另有研究显示，组蛋白H3 赖氨酸4、组蛋白H3赖氨酸9和组蛋白H4赖氨酸16等在被修饰的同时也调控自噬水平[29]，其中组蛋白H3赖氨酸9双甲基化参与自噬的早期阶段，组蛋白H4赖氨酸16乙酰化水平下降可通过下调组蛋白乙酰转移酶表达水平参与自噬的晚期阶段[30]。此外，去乙酰化酶抑制剂伏立诺他能够提高组蛋白H3/H4的乙酰化水平，而郭元成等[31]使用伏立诺他处理MDS细胞SKM-1后发现，细胞内自噬微管相关蛋白1轻链3和Beclin-1蛋白的表达明显增加。

2.3.2微RNA(microRNA，miRNA)调控自噬 miRNA通过诱导靶信使RNA降解或抑制靶信使RNA的翻译实现转录后的基因调控作用。研究发现，miRNA可通过直接或间接的方式参与自噬过程的自噬诱导、自噬囊泡成核、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合和自噬体降解5个阶段[32]。自噬泡的延伸涉及ATG5-ATG12-ATG16泛素化蛋白结合系统，而miR-181a能够靶向抑制自噬基因ATG5的表达阻碍ATG5-ATG12-ATG16多聚体形成，减少细胞自噬[33]。Santamaria等[34]使用实时荧光定量聚合酶链反应法证实，miR-181a在MDS来源的BMSC中表达下调，下调的miR-181a可能导致BMSC出现自噬性死亡，从而使其失去精细调控HSC的能力导致MDS。

除能直接靶向调节自噬关键基因表达的 miRNA 外，还有一些能间接调控自噬调节因子的miRNA可能参与MDS的发病。其中，miR-195可通过靶向下调沉默信息调节子1介导心肌细胞发生细胞自噬性凋亡作用，Xu等[35]通过半定量反转录聚合酶链反应发现与正常对照者相比，MDS患者的miR-195-5p水平上调。同时，Sun等[36]在MDS异常克隆的HSC内发现沉默信息调节子1蛋白表达水平显著降低，故推测MDS肿瘤细胞内高水平的miR-195-5p能够靶向沉默信息调节子1促进细胞发生自噬性死亡。

3 小 结

细胞自噬是细胞在恶劣生存条件下的应激反应，其不仅可以影响HSC增殖分化和健康骨髓微环境，还可以被表观遗传调控在MDS的发病机制中产生一定的作用。临床上，虽无明确自噬诱导分类的药物用于MDS的治疗，但已广泛用于中高危MDS患者的诱导沉默肿瘤抑制基因再表达的去甲基化药物(阿扎胞苷和地西他滨)治疗作用机制的研究证实，去甲基化药物能够提高肿瘤细胞的自噬水平发挥抗肿瘤效应[26]。目前，国家食品药品监督管理总局已经批准了氯喹、羟氯喹、雷帕霉素等多种自噬相关调节剂在实体肿瘤和血液恶性肿瘤，以及自噬调节剂与传统化疗方式联合治疗慢性髓系白血病中的临床研究，这为如何有效联合运用自噬调节剂与现有MDS治疗手段提供了参考。此外，当前的MDS治疗药物无法完全清除肿瘤细胞，未来应研究如何利用自噬调节剂增强药物对MDS细胞的杀伤作用。