基因芯片在宫颈癌中的研究进展

邓波儿，孔为民

(首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100006)

基因芯片又称DNA微阵列，是从基因水平观察细胞的差异，从而对不同细胞的生物学行为进行分析的技术，目前已有大量研究证实基因芯片结果的可靠性和合理性[1]。与正常组织细胞对比，肿瘤细胞的原癌基因、抑癌基因和凋亡基因存在一定程度的异常表达和功能紊乱。了解肿瘤细胞的突变基因靶点及下行通路，并进行人为干预，可能为治疗肿瘤提供新方法。基因芯片因可高通量、大规模检测基因，已经广泛应用于肿瘤研究[2]，不仅提高了研究效率，也为深入研究基因功能提供了可能[3]。肿瘤性疾病是一种基因性疾病。成松桃等[4]通过基因芯片筛选出可能作为膀胱癌潜在生物学标志的候选基因，为后续研究膀胱癌提供了有价值的线索。胡晓霞等[5]通过基因芯片技术对宫颈癌和正常宫颈组织中微RNA(microRNA，miRNA)的表达进行差异分析，并借助基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书信号转导通路富集分析技术，预测了可能与肿瘤发生有关的靶点，为后续研究提供了依据。随着基因本体功能富集分析、京都基因与基因组百科全书信号转导通路富集分析、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和蛋白质印迹法等技术的逐渐完善，一方面为研究基因功能、蛋白网络调控分析提供了更多的信息；同时，为进一步探讨基因表达差异及细胞生物信息学分析创造了条件。现就基因芯片在宫颈癌中的研究进展予以综述。

1 基因芯片概述

基因芯片是一种测定基因信息的生物芯片，其表面固定了大量的基因探针，根据载体性质不同，基因芯片的种类包括硅片、玻璃片及尼龙膜等。以基因芯片技术为代表的宏观基因组学技术已经成为生物生态学领域的研究热点，在近20年得到了飞速发展[6]。为了促进交流和比较，2001年基因芯片表达数据协会提出了基因芯片试验标准方案，即MIAME(minimal information about a microarray experiment)原则[7]，使芯片的数据结果更具有可比性和可靠性。

1.1原理 基因芯片的原理为核酸杂交原理，与Southern印迹杂交、Northern印迹杂交原理类似，即碱基对之间的配对，使一组已知的核酸探针与目的核酸之间进行杂交，从而对目的核酸序列进行测定[8]。基因芯片技术是同时将大量的已知序列的DNA探针固定在载体上，再与荧光标记后的待测样本进行杂交，一次可获得大量基因信息。一个基因芯片上往往包含了上万种已知的核酸序列，称为核苷酸探针。通过荧光显像的原理，根据杂交情况不同，基因芯片扫描仪得到的芯片荧光图不同，最后，将获得的图像信息转化成数据信息，即可获得一组基因序列，从而对基因序列进行测序。

1.2基因芯片技术的基本步骤 基因芯片是由平面微细加工技术和超分子自组装技术将大量已知的基因探针集成在一个微小的固体基片表面。根据固体表面材质的不同，所固定的基因探针长度和数量均不相同，应用范围也不相同。借助该集成技术，基因芯片可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片检测DNA序列的步骤主要包括：芯片制备、样品制备、生物分子反应、芯片信号检测和数据分析。其中，基因芯片的制备是实现该技术可靠性和真实性的关键。目前国内外对基因芯片的制备主要包括两种方法：原位合成法和合成后交联法，原位合成法适用于高密度寡核苷酸芯片，合成后交联法合成方法较简单，多利用手工或自动点样，将制备好的互补DNA样品点在载体上，密度较低[9]。基因芯片得以大量应用于实验得益于可将大量探针分子固定于支持物上，通常每平方厘米点阵密度高于400。原位合成法因密度高、重复性好有较大的应用前景。基因芯片数据的预处理方法主要包括LnMR和RAln两种方法，郑乔舒等[10]对这两种方法进行了比较分析，发现LnMR法更适合检测不同组间微生物的结构差异，而RAln法一定程度上可以消除基因芯片测定的系统误差。两者都是有效的预处理方法，具体如何选择需要结合实际分析问题。

2 基因芯片在宫颈癌研究中的作用

2.1通过绘制表达谱，寻找宫颈癌相关基因 基因芯片可从DNA水平探究疾病的发病机制。通过对正常组织细胞和宫颈癌组织细胞的差异基因的筛选，有助于寻找宫颈癌相关基因，在了解靶基因的基础上开展下一步研究。张蔚等[11]研究发现，miR-497-195基因簇在宫颈癌组织中低表达，可能是宫颈癌的抑制因子，对预测宫颈癌的靶基因提供了一定帮助。Zhu等[12]通过寡核苷酸基因芯片对正常组织和宫颈癌组织凋亡基因进行了研究分析，确定了正常宫颈组织和宫颈癌组织存在上千个差异基因，其中BCL2、BCLXL和细胞凋亡抑制蛋白1等基因在晚期宫颈癌组织中较早期癌症表达上调，提示可能与宫颈癌的发生、发展相关，或可作为治疗的靶基因，为进一步研究提供了依据。由于互补DNA表达谱芯片的存在，基因芯片可直接检测miRNA的种类及丰富度，利用基因芯片技术，可对某一基因功能进行深入研究。朱正等[13]对宫颈癌组织及癌旁组织进行了差异表达基因的筛选，发现相对于癌旁组织，宫颈癌异常表达的miRNAs共有27个，表达上调超过1.5倍的有3个，包括hsa-miR-891a、hsa-miR-937、hsa-miR-F114；表达下调超过1.5倍的miRNAs有24个，主要包括hsa-miR-126和hsa-miR-26a，而hsa-miR-126和hsa-miR-26a可能与宫颈癌的发生、发展有关，可作为宫颈癌发生的靶基因进行深入的研究。韦丽娅等[14]对上调miR-205表达的HeLa细胞与正常表达miR-205的HeLa细胞进行分析，发现两种细胞的差异表达基因中，许多参与了细胞增殖及细胞周期，表明miR-205表达引发宫颈癌的过程是多因素、多基因共同作用的结果，为今后进一步研究证实宫颈癌发生的分子机制提供了基础。此外，Wang等[15]借由基因芯片技术首次对宫颈鳞癌患者手术前后循环中的miRNA表达差异进行分析，发现循环中miR-646、miR-141和miR-542-3p可以作为宫颈鳞癌的非入侵性生物标志物，可能对疾病进展的治疗后监测有用。

2.2宫颈癌人乳头瘤病毒 (human papilloma virus，HPV)感染情况的研究 HPV是一种嗜上皮性DNA病毒，与宫颈癌的发生密切相关，是宫颈癌发生的必要条件[16]。目前已发现HPV有超过近百种分型，低危型HPV(如HPV6、HPV11型)主要引起良性病变；高危型HPV(如HPV16、HPV18型)不仅可导致宫颈癌前病变，还可促使宫颈癌前病变向宫颈癌迁移[17]。另外，基因芯片对了解宫颈癌的流行病学分布具有较大临床意义。蔡为民等[18]对1 047例正常宫颈细胞、161例宫颈鳞癌组织和82例宫颈腺癌组织标本进行检测，发现HPV的感染率分别为10.41%(109/1 047)、90.68%(146/161)和71.95%(59/82)，提示HPV与不同病理分型的宫颈癌均关系密切。Kim等[19]也发现，HPV的阳性率与宫颈癌细胞来源有很大程度的关系。宫颈腺癌是宫颈癌的一种特殊病理类型，近年来宫颈腺癌在宫颈癌中所占的比例有所上升，并呈现年轻化的趋势[20]。宫颈腺癌因对放化疗较鳞癌不敏感，发生淋巴结转移也更早，因此，早期诊断并治疗对宫颈腺癌更为重要。邹琳等[21]对HPV在宫颈腺癌中的感染情况及分型进行了研究，发现47例宫颈腺癌标本中，HPV阳性率为93.6%(44/47)，单一型感染以HPV16型最为常见，占14.9%(7/47)；混合型感染以HPV16+HPV18型为最主要类型，占19.4%(6/31)，对明确HPV在宫颈腺癌中的作用及了解感染情况有较大意义。

近年来，HPV-DNA基因芯片发展迅速，已经可以同时检测多种HPV亚型。李明等[22]研究发现，Luminex液相基因芯片技术作为目前进行HPV分型评价最高的检测手段，不仅可以一次性完成26种亚型的检测，通过与基因测序结果对比，准确率也较高(90%)，是HPV分型检测及大规模筛查的理想方法。另外，导流杂交基因芯片技术也是检测HPV感染和分型的常用技术之一。刘永良[23]利用导流杂交基因芯片对1 760例疑为HPV感染的门诊患者进行HPV感染的流行病学调查，结果显示，HPV检出率为27.2%，高危型以HPV16型最高(21.4%)，其次为HPV58(12.2%)，再次之为HPV52(11%)，而低危型以HPV81和HPV11最为多见。袁征等[24]利用核酸分子快速导流杂交芯片技术对HPV感染进行研究，结果表明，宫颈上皮内瘤变Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期及宫颈癌的HPV检出率分别为32.0%、51.9%、80.0%和94.4%，诊断率与宫颈病情成正比，应用核酸分子快速导流杂交芯片可有效提高宫颈病变的诊断水平。黄德秋等[25]的研究也发现，导流杂交法基因芯片技术对了解HPV感染和亚型分布情况有积极意义。

2.3宫颈癌病理分型相关基因研究 宫颈癌的病理分型主要包括鳞癌、腺癌及腺鳞癌等，不同的病理类型预后差别较大，术后采用的辅助治疗方案也有差异。因此，明确病理分型对宫颈癌的治疗和改善患者预后有较大意义。已有研究表明，应用基因芯片技术可对鳞癌及腺癌中不同的基因序列进行分析，帮助诊断癌症的病理类型[26]。利用基因芯片进行肿瘤分型可帮助指导临床决策，制订更个体化的治疗方案。Fujimoto等[27]通过基因芯片筛选出可能与病理类型相关的10个差异基因，并通过反转录PCR技术进行了验证，结果表明，其中9个基因在不同病理分型的宫颈癌中差异表达，可能与宫颈癌组织类型有关。当临床病理不明确，或免疫组织化学结果不能充分区分病理类型时，可通过基因芯片进行差异表达基因的分析，辅助诊断病理组织学类型，指导治疗。但具体与宫颈癌病理类型相关的基因研究目前较少，仍需大量实验证实。

2.4宫颈癌浸润及转移机制的研究 宫颈癌主要转移机制为淋巴转移，应用基因芯片技术可了解可能参与淋巴转移机制的靶基因。林颖等[28]利用基因芯片对早期宫颈鳞癌的淋巴转移机制进行了研究，分别对发生淋巴转移、未发生淋巴转移的宫颈鳞癌组织及正常宫颈上皮之间的差异表达基因进行分析，结果表明，早期宫颈鳞癌淋巴转移是由多个基因共同作用的结果，其中LRRC4(leucine rich repeat containing 4)、VSNL1(visinin-like protein-1)和表面生长因子受体可能与宫颈癌的转移和预后相关。Huang等[29]对发生盆腔淋巴结转移的宫颈癌患者进行差异表达基因分析，发现11个可能与盆腔淋巴结转移相关的基因，且具有该11个基因的高风险分数患者的5年生存率和无病生存率较低风险分数患者低，为进一步研究宫颈癌的转移浸润机制提供了依据。ΔNp63a是p63基因的转录产物之一，已被证实与宫颈癌组织分化程度及预后有关，低表达该基因的患者发生转移和复发的可能性较高[30]。韩晓慧等[31]对ΔNp63a过表达和正常表达的宫颈SiHa细胞进行差异基因的筛选，发现在ΔNp63a过表达的宫颈SiHa细胞中有834个上调基因和562个下调基因；结合京都基因与基因组百科全书通路分析，发现与ΔNp63a直接相关的基因编码蛋白为骨形成蛋白7和白细胞抗原74，骨形成蛋白7和白细胞抗原74作为ΔNp63a的候选基因可能与ΔNp63a共同介导宫颈癌中免疫相关的信号通路，从而影响肿瘤的发展。

2.5宫颈癌治疗机制的研究 基因芯片在研究肿瘤的治疗方法中也发挥着重要作用。隋成君等[32]对行介入治疗前后的宫颈癌细胞进行了基因表达谱分析，发现行介入治疗后的肿瘤细胞有939个下调基因，223个上调基因，这些差异基因主要参与DNA修复、乳腺癌1号基因、抑制蛋白及乳腺癌2号基因相关通路，为进一步研究宫颈癌介入治疗的分子机制提供了思路。另外，放疗是宫颈癌中晚期患者的主要治疗方式。放疗的本质是通过放射线使DNA失去双螺旋结构，变成单链结构，从而使肿瘤细胞失去增殖的能力。然而，肿瘤细胞具有较强的DNA双链修复能力，使肿瘤细胞拥有一定的放疗抵抗性。肿瘤对放疗的敏感性决定了放疗的临床效果。因基因芯片用于筛选与放疗敏感性的相关基因，一方面可确定不同肿瘤细胞株对放疗的敏感性，另一方面还可以比较两者基因之间的差异，帮助寻找放疗敏感性相关的靶基因。王凤玫等[33]通过基因表达谱芯片对宫颈癌放疗敏感性进行了相关研究，筛选出了可能与宫颈癌放疗抵抗相关的差异表达基因，并通过荧光定量PCR对部分基因进行了验证，结果表明，反转录PCR与基因芯片结果一致，差异表达基因(如BCL2、MDM2等)主要参与DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡等功能。

3 基因芯片研究基因的优缺点

3.1基因芯片的优点 基因芯片技术根据自身高通量、自动化等特点，广泛应用于生命科学领域，不仅可以用于基因组学的研究、疾病的检测，还可以诊断基因序列突变等[8]。基因芯片的飞速发展对于肿瘤科学的研究有重要价值。如上所述，基因芯片技术在宫颈癌HPV感染的相关研究中发挥了重要作用，在检测宫颈癌HPV感染情况上有独特优势，可同时进行多种HPV型的检测；同时，基因芯片也提高了宫颈癌筛查和临床检测的准确性和可靠性。目前，临床上检测HPV分型常采用PCR法。与传统方法相比，基因芯片可同时检测几十种不同分型的HPV感染，并可避免假阳性及假阴性结果，且灵敏度无差异，特异性强[20]。基因芯片技术可与HPV检测的传统技术结合，提高临床诊断率，帮助早期诊断宫颈癌前病变及宫颈癌。

3.2基因芯片的缺点 基因芯片作为一项分子生物学技术，需要强大的理论基础和较强的操作能力。伴随基因芯片高通量而来的还有庞大的数据结果，需要应用相关软件进行数据分析，一定程度上加大了基因芯片技术的难度。有研究显示，基因芯片对染色体倍数正常的基因组发生倒位和易位等突变不能有效筛查，限制了其在产前诊断等方面的应用，且基因芯片费用昂贵[34]。此外，基因芯片可以检测的基因型仍有限，只能对已知序列的基因组进行分析，而对于未知物种的基因测序及发生变化的基因序列进行分析等尚不能实现，且成本相对较高[35]。

4 小 结

基因芯片是一种基因测序方法，在肿瘤医学中的临床应用较多，近年来发展迅速。基因芯片技术可以用于宫颈癌的表达谱绘制、宫颈癌HPV感染情况的分析、宫颈癌的病理、转移及治疗机制的研究等，可以为临床治疗提供思路和依据。但目前基因芯片技术仍有许多不足之处，例如，可检测的基因型有限、成本相对较高、结果分析需要较高的理论基础、基层医院开展较困难等。相信随着未来基因芯片技术的不断提高和更新，随之可能会出现更加有效的宫颈癌预防及治疗方法。未来，快速、准确且低成本基因芯片筛查方法的出现及普遍应用，将为宫颈癌的防治做出巨大贡献。