遗传性球形红细胞增多症相关基因突变的研究进展

王臣玉，张耀东，张迎辉※

(1.新乡医学院，河南 新乡 453003；2.河南省儿童医院儿科，郑州 450018)

遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis，HS)又称先天溶血性贫血，其在世界范围内均有发病，主要因先天性红细胞膜骨架蛋白异常所致，目前临床主要采用部分脾切除、脾动脉栓塞术及全脾切除治疗，HS患儿常散发性就诊，误诊及漏诊率较高，易延误救治时间，威胁患儿生命安全[1-3]。HS发病的分子机制是红细胞膜骨架缺陷，导致表面积减少，并促使其发生球形改变，导致红细胞膜弹性及机械稳定性丧失，这主要与基因突变有关[4]。HS可分为常染色体显性遗传和隐性遗传，其分子遗传学基础具有异质性，红细胞膜蛋白缺陷类型及基因突变类型均存在明显差异。研究表明，SLC4A1(编码带3蛋白)、ANK1(编码锚蛋白)、SPTA1(编码α-血影蛋白)、SPTB(编码β-血影蛋白)、EPB42(编码4.2蛋白)等基因的突变与HS密切相关[5]。有研究显示，带3蛋白缺陷与锚蛋白缺陷是HS患儿红细胞膜蛋白缺陷的主要类型[6-7]。目前关于HS相关基因突变的研究较少，现就基因突变与HS关系的研究进展进行综述，以期为临床诊断HS及产前优生检查提供参考依据。

1 HS主要临床表现及其病机

1.1主要临床表现 HS轻度患儿无明显症状，根据家族史及实验室检查(外周血涂片球形红细胞计数、红细胞渗透脆性试验、骨髓细胞学检查等)明确诊断；中度与重度患儿表现为贫血、黄疸、脾肿大等[8]，部分患儿合并胆囊结石，临床表现异质性明显，同时需与营养性贫血、自身免疫性溶血性贫血、血红蛋白病等相鉴别。研究显示，HS患儿发病率明显高于临床诊出率[9]。外周血球形红细胞增多、红细胞渗透脆性增加、慢性贫血伴急性溶血等是HS的主要临床特征，而球形红细胞计数、红细胞膜蛋白分析及基因检测等均可用于HS的诊断[10]。HS属于遗传性溶血性贫血，患者临床病理特征较为严重，并具有蛋白缺陷及异质性遗传等特点，其主要临床特征为红细胞球型改变及渗透脆性增加等。HS新生儿出现严重贫血及黄疸时需接受输血治疗，甚至光疗等，婴儿期未有明显症状，年长儿发病时以轻度黄疸、贫血为主要临床症状，其发病原因主要为受凉感冒或过度劳累等，成年期HS以贫血、黄疸及脾肿大为主要临床表现，外周血涂片检测发现球形细胞和红细胞渗透脆性增加。

1.2HS发病机制 HS的发病机制主要是红细胞膜骨架蛋白基因突变，导致红细胞膜网状结构发生变化，进而促使红细胞变为球形，由于球形红细胞变形能力差，导致易被破坏而发生溶血性贫血。红细胞膜的主要组成成分为蛋白质、脂质以及糖类，其中蛋白质主要由锚蛋白、膜血影蛋白、4.1蛋白、4.2蛋白等组成[11]，蛋白质主要组成蛋白发生改变可引发红细胞膜结构改变，进而影响HS的发生。膜蛋白缺陷：①锚蛋白缺陷。编码基因为ANK1，蛋氨酸与异亮氨酸内含子剪切位点G→A突变引起该蛋白缺陷。②血影蛋白β缺陷。编码基因为SPTB，属于常染色体显性遗传，SPTB基因突变可促使该蛋白缺失，进而引发椭圆形红细胞增多症。③血影蛋白α缺陷。在北欧居民中，血影蛋白α缺陷约占5%，可引发HS，呈常染色体隐性遗传[12]。④带3蛋白缺陷。有调查显示，因带3蛋白缺失导致HS的人数占HS患者的54%(162/300)，其编码基因为SLC4A1，呈常染色体显性遗传，SLC4A1基因突变可促使红细胞变为球形[13]。⑤带4.2蛋白缺陷。因带4.2蛋白缺失引发的HS人数较少，EPB42基因可编码该蛋白，并呈常染色体隐性遗传，该蛋白缺失可改变细胞膜竖向结构，进而促使红细胞变为球形，导致溶血发生[14]。溶血机制：红细胞膜性质改变导致变形能力下降，并促使其形态变为球形，球形红细胞膜蛋白磷酸化功能降低，离子通透性增加，导致钠泵作用明显增强，继而促使细胞膜硬化，一旦经过脾窦微血管，球形红细胞将被滞留，进而被巨噬细胞吞噬，星儿导致血管外溶血的发生[15]。

2 HS基因突变研究

2.1SLC4A1基因

2.1.1SLC4A1基因及其编码的带3蛋白 SLC4A1基因位于染色体17q21，可编码带3蛋白。带3蛋白主要分布在小肠上皮细胞、红细胞及淋巴细胞中，其约占红细胞蛋白总量的25%[16]。研究显示，带3蛋白具有调节糖酵解酶活性以及维持红细胞膜骨架稳定等功能[17]。提示带3蛋白缺失可导致红细胞膜表面积减少，并降低红细胞膜骨架稳定性，进而导致红细胞变为球形。

2.1.2SLC4A1基因突变与HS 研究显示，HS患儿及其父亲均发生SLC4A1基因Arg808His位点突变，即G→AG→A突变，但DNA序列检测发现其祖父母未发生相同突变，提示患儿父亲发生Arg808His新型突变，并与带3蛋白缺失密切相关[18]。研究显示，SLC4A1基因内含子剪切位点50处缺失G等位基因，导致丙酮酸激酶活性降低，从而造成红细胞ATP含量减少[19]。SLC4A1基因突变可加重HS患者血管外溶血倾向性。通过对HS患儿进行基因测序发现，SLC4A1基因14号外显子1885-1888处发生CCGG重复杂合子突变，其直接导致移码突变，进而促使其成为不稳定蛋白，并丧失正常功能[20]。相关研究发现，HS患儿发生新型杂合子突变并存在SLC4A1基因13号外显子单核苷酸GAG→AAG(Glu508Lys)突变，其父母不是HS患者且均不存在此突变[21]，分析可能是生殖细胞减数分裂末期产生的新型突变，其中Glu508Lys位于带3蛋白的跨膜区，这可能导致患儿带3蛋白功能发生改变。

SLC4A1等位基因的突变形式具有多样性，HS常见致病原因为SLC4A1杂合突变，其主要发生在带3蛋白胞质和跨膜区，而SLC4A1基因杂合突变促使带3蛋白减少20%～30%[22]。同一家族中SLC4A1基因杂合突变交叉互换后，各家族成员间可能存在不同表现形式[22]。SLC4A1基因编码的带3蛋白Coimbra突变属于纯合突变。有调查显示，1例HS患儿母亲前两胎均于宫内早期死亡，随后跟踪调查患儿母亲第3次孕期，抽取怀孕时患儿心包积液及腹水进行分析发现，患儿红细胞呈多样性且脆性极高，探究其原因发现，SLC4A1基因纯合突变导致带3蛋白缺失，进而促使上述现象发生[23]。以上研究表明，无论SLC4A1基因发生杂合突变还是纯合突变均可引发带3蛋白缺失，进而促使红细胞变形，导致HS发生。

2.2ANK1基因

2.2.1ANK1基因及其编码锚蛋白 ANK1基因位于人染色体8p11.2，主要在红细胞膜中表达，并连接阴离子通道和收缩蛋白等。ANK1编码基因序列中5′端215 bp是具有启动子活性的基因片段，并可激活红细胞锚蛋白，具有一定的特异性[24]。ANK1基因可编码锚蛋白，而锚蛋白62 000结构域含有收缩蛋白结合肽，其能够与β-收缩蛋白磷酸化后的锚蛋白上的位点结合，进而维持红细胞形态，55 000结构域能调节带3蛋白的功能，若锚蛋白合成减少导致膜上的锚蛋白组装及异常组装锚蛋白生成量减少，锚蛋白缺失可减弱成膜骨架与脂质双分子层间垂直方向的相互作用，进而降低脂质双分子层稳定性，其中脂质还可变为囊泡而丢失，进而减少红细胞膜表面积，最终导致红细胞变为球形[25]。以上提示锚蛋白与带3蛋白可相互作用，并在红细胞结构及形态维持中发挥重要作用。由此可知，在锚蛋白合并收缩蛋白缺陷型HS中，锚蛋白缺陷是主要病因，究其主要原因为ANK1基因突变引发锚蛋白缺陷，进而造成膜收缩蛋白缺陷，锚蛋白与带3蛋白无法正常连接导致收缩蛋白丢失。

2.2.2ANK1基因突变与HS ANK1基因突变引发的HS主要为显性遗传，突变类型主要为无义突变、移码突变及剪接突变，其中无义突变可降解信使RNA，进而增加锚蛋白转录的不稳定性。在部分无义突变导致的HS患儿中，正常等位基因异常高表达时可代偿性弥补锚蛋白缺陷，从而影响HS的严重程度[26]。临床数据显示，HS显性遗传患者中，锚蛋白合并收缩蛋白缺陷者病情较轻；在HS隐性遗传者中，锚蛋白合并收缩蛋白缺陷者病情较为严重，甚至危及生命[27]。HS相关ANK1基因突变体还包括Marburg等移码突变锚蛋白[28]。有研究指出，锚蛋白缺陷的隐性HS患儿中ANK1基因启动子序列存在明显变化，启动子发生突变致使转录因子结合位点破坏，从而导致锚蛋白合成减少，此外ANK1基因启动子突变主要包括108T→C、153G→A等[29]。无论是常染色体显性遗传还是隐性遗传，ANK1基因突变可降低锚蛋白的合成，进而影响HS的发生及发展。

研究显示，HS患者ANK1基因16号内含子中发生G→A突变，引发外显子上游序列改变，进而产生新型受体剪接位点，而新型突变型锚蛋白Ankara与ANK1基因异常剪接密切相关[30]。ANK1基因新生突变常出现在母体生殖细胞中，研究表明，HS患儿体内出现ANK1基因新型杂合子无义突变，ANK1基因1号外显子单核苷酸发生G→T突变，而患儿父母均不存在此突变，其可能是在生殖细胞前体分化过程中形成的新生突变，患儿发生严重溶血及贫血[31]。研究表明，ANK1基因33号外显子L1340p T→C突变与特定HS类型有关，经研究证实该位点基因突变为该患儿发病的分子基础[32]。研究发现，ANK1基因c.399位点T→G突变可能是儿童HS的致病基因[26]。目前关于HS相关基因的研究相对较少，ANK1基因突变与HS发病机制的关系及其具体作用机制可作为研究重点，为临床遗传咨询及产前诊断提供参考。

2.3HS其他相关基因 HS相关基因还包括EPB42、SPTB、SPTA1，其中EPB42基因位于人染色体15q15～q21，编码的4.2蛋白含721个氨基酸，并可与锚蛋白、带3蛋白结合，与细胞膜内表面相连接，且较为稳定，同时还与膜骨架网架连接，是脂质双分子层与膜骨架之间必不可少的纽带之一[13]。目前研究发现，EPB42基因存在两个单核苷酸多态性，即c.329位点C→T和c.2997位点G→A，经检测证实患儿母亲也存在c.329位点C→T突变[33]。一项韩国的家庭病例报道显示，母亲患有HS，其第三个儿子及其两个孙子也患有HS，基因检测发现，SPTB基因新型无义突变是导致这一现象的根本原因[34]。关于HS的其他相关基因及其是否存在HS致病基因突变均需进行多方面验证，根据临床表型及基因遗传方式确定其中具体关系。

3 HS诊断

HS诊断主要分为典型HS诊断与非典型HS诊断，其中典型HS诊断主要依据外周血涂片，浓染细胞增加较球形红细胞增加较多是HS诊断金标准之一[35]。红细胞渗透脆性试验、酸化甘油溶解试验易受多种因素影响而降低了诊断效能。由于非典型HS患儿临床表现轻微甚至无症状，因而血涂片不能有效诊断，伊红-5′-马来酰亚胺集合试验可有效诊断，且具有较高的灵敏度和特异性，其主要采用流式细胞仪检测荧光强度以判断是否患有HS，伊红-5′-马来酰亚胺集合试验还可用于诊断遗传性热异形细胞增多症和遗传性口形红细胞增多症，新生儿未能有效获得病理诊断时不可否定HS的诊断，需在6月龄后进行相关检查[36]。

实验室检测HS时还可采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测α/β血影蛋白、锚蛋白、带3蛋白及带4.2蛋白等的相对表达量，但检测结果准确性较低，同时带3蛋白及带4.2蛋白降低又可影响α/β血影蛋白、锚蛋白电泳条带含量[13]。对分子生物学基因的研究有助于提高HS患儿的诊断率。基于既往研究，现代研究采取膜蛋白基因突变分析鉴定基因突变，此方法可有效辨别原发或继发基因缺陷甚至新生突变，采用限制性片段长度多态性连锁分析等分子生物技术可确定HS疾病进展与某个基因的关联性，进一步采用实时荧光定量聚合酶链反应、聚合酶链反应一单链构象多态性分析等方法可鉴定膜蛋白基因突变位点，变性高效液相色谱分析可直接检测出单核苷酸变异，其具有灵敏度高、效率高等优点，但膜蛋白基因突变分析技术耗时且费用较高，因而尚未普及应用。

4 小 结

HS作为遗传性红细胞膜缺陷病，探寻诊断HS的决定性指标对提高诊断准确率及治疗效果均具有重要意义。分子生物学指标可用于HS的诊断，其致病相关基因主要有SLC4A1、ANK1、EPB42、SPTB、SPTA1，其中SLC4A1、ANK1基因突变与HS发生最为紧密，由于不同种族或地区HS致病基因及膜蛋白缺陷类型存在明显差异，因而需进一步探索并建立适合本地区HS患儿红细胞膜蛋白分析及基因诊断的方法，以期为HS诊疗及优生优育的产前诊断提供支撑依据。