蛋白C途径的抗炎及其在自身免疫性疾病中的作用

袁叶双，蒋 科，杨小红,3※

(1.川北医学院微生物学与免疫学教研室，四川 南充 637100；2.川北医学院附属医院骨科，四川 南充 637000；3.川北医学院第二附属医院免疫室，四川 南充 637100)

蛋白C是一种丝氨酸蛋白酶酶原，其经凝血酶作用形成活化蛋白C(activated protein C,aPC)，具有抗凝血、细胞保护、抗炎及抗凋亡等作用。临床试验(PROWESS和PROWESS-SHOCK)显示，重组人活化蛋白C在缺血性损伤时具有抗炎和保护神经及脑血管内皮的作用[1]。鉴于aPC明确的抗炎及抗凝血作用，美国食品药品管理局曾批准礼来公司的重组人活化蛋白C(商品名 Xigris)用于治疗中毒脓血症和脓血症休克。然而，Cochrane系统评价提示Xigris可增加严重出血导致的死亡风险[2]，故礼来公司于2011年宣布Xigris退市。3K3A-APC是一种aPC的基因工程变构体，有研究显示，3K3A-APC的抗凝血能力较天然aPC降低90%左右，而在抗炎作用、神经和血管保护作用等其他方面未发现明显改变[3-6]。目前，3K3A-APC治疗急性缺血性脑卒中的Ⅱa期临床试验(RHAPSODY)已经结束，初步结果显示其可以有效降低颅内出血的风险[7]。同时鉴于3K3A-APC的抗炎和血管保护作用，其还有可能成为新的治疗炎性疾病(炎性肠病、哮喘、类风湿关节炎等)的方法。现就蛋白C途径的抗炎及其在自身免疫性疾病中的作用予以综述。

1 蛋白C的结构与功能

蛋白C是一种维生素K依赖的血清蛋白酶酶原，由肝脏产生，其在正常血浆中的浓度约为70×10-9mol/L，而其活化形式aPC只有40×10-12mol/L[8]。在健康人体内，蛋白C的半衰期约为8 h，而aPC约为15 min[3]。蛋白C以单链形式存在于循环中，含419个氨基酸。当蛋白C与细胞膜上的内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein C receptor,EPCR)结合后，其在第169位精氨酸处被凝血酶-血栓调节蛋白复合物水解成两条肽链(轻链和重链)，轻链第141位半胱氨酸和重链第277位半胱氨酸间形成二硫键连接后活化为aPC。依据结构和功能，aPC分为3个区域：①轻链N端的γ-羧基谷氨酸区域，这是与蛋白S和Ca2+结合的区域；② 2个表皮因子同源区域；③重链C端的丝氨酸蛋白酶区域，为活性区域[9]。

aPC在蛋白S和Ca2+的协助下使凝血因子Ⅴ在第306位精氨酸和第506位精氨酸处及凝血因子Ⅷa在第336位精氨酸或第562位精氨酸处水解，使凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷa不可逆的失活，从而抑制凝血途径。与凝血因子Ⅷa不同，凝血因子Ⅴa需要同时对2个位点进行剪切才能灭活，基因变异型凝血因子Ⅴa Leiden个体因第506位精氨酸被谷氨酰胺替代而不能被aPC灭活，所以常发生静脉血栓[10]。有研究对aPC的晶体结构进行分析发现，其一侧包含3个外显袢：39-loop、60-loop和70-80-loop，通过基因诱变使3个袢中的氨基酸突变，均可造成aPC的抗凝功能部分丧失，表明这3个袢是aPC发挥抗凝作用的活性部位[9，11]。而在aPC结构的另一侧，包含能与EPCR结合的位点，从而使aPC通过该受体发挥多种生理学作用，人们对其中的抗炎作用较为感兴趣。

2 蛋白C系统

一般认为，aPC与内皮细胞表面EPCR结合后能产生多种不同的作用，其中主要有抗凝血作用和细胞保护作用。aPC的细胞保护作用包括抗凋亡和抗炎活性，以及稳定内皮屏障的能力。这些细胞保护作用通常需要EPCR，并涉及aPC激活G蛋白偶联受体蛋白酶激活受体(protease-activated receptor,PAR)1的能力。PAR-1激活后可以调节多种信号通路，如通过核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的细胞表面黏附分子；还可以通过PAR-1在体外激活内皮细胞中的促分裂原活化的蛋白激酶途径[12]。实验证实，当缺乏EPCR或PAR-1时，蛋白C途径信号通路无法正常进行[13]。此外，aPC还有其他信号转导途径，这些途径可能需要PAR3、鞘氨醇-1-磷酸受体1、Mac-1、载脂蛋白E受体2、表皮生长因子受体、tie2和(或)其他受体参与，其中有一些信号转导途径不需EPCR的参与[14-16]。

2.1EPCR EPCR是一种跨膜蛋白，其空间结构与CD1d家族蛋白同源。EPCR的抗原呈递区可以与磷脂结合，并导致蛋白C释放。EPCR一般分布在一些器官的血管内皮上，少量分布在微血管上，另外其在一些细胞膜上也有表达，如单核细胞、中性粒细胞、神经元等[17]。关于蛋白质晶体结构的研究显示，EPCR主要与蛋白C的γ-羧基谷氨酸端ω-loop上的Phe-4和leu-8位点结合[18]。EPCR作为蛋白C信号通路的重要受体，其与aPC结合可以引起PAR-1激活，并引起后续一系列细胞保护作用[19]。且EPCR作为aPC激活PAR-1的共受体，可以介导aPC的细胞保护作用，同时也可以作为PAR-1信号通路中的变构调节剂[20]。但aPC与EPCR结合无法直接传递信号，其在细胞膜表面的表达可以影响aPC的作用。

有证据显示，EPCR表达减少是引起炎症的原因之一[21]。在炎症反应中内皮细胞受到损伤，膜表面的EPCR脱落到血浆或尿液中形成可溶性EPCR。可溶性EPCR对aPC的亲和力不变，其能与aPC结合但无法进一步传导信号，因此可视为一种竞争性拮抗剂[21]；同时，可溶性EPCR也可作为一种炎症反应生物标志物在多种疾病中应用，如败血症、系统性红斑狼疮等[22]。此外，可溶性EPCR可通过活化的中性粒细胞分泌蛋白和β2整合素Mac-1复合物与活化的中性粒细胞膜结合并被分解[23]。

2.2PAR-1 PAR是一种G蛋白偶联受体，其可以通过检测内皮细胞、血小板、神经元、免疫系统细胞和其他细胞直接环境中的特异性蛋白酶，并与之结合激活适当的细胞信号途径。PAR-1为aPC细胞保护作用激活信号的主要受体，aPC激活PAR-1需要EPCR的介导[19,24]。最早发现的PAR-1经典激活途径由凝血酶激活[25]，并介导产生破坏性作用，且凝血酶对PAR-1的催化效率是aPC的3～4倍[26]。PAR-1被凝血酶和aPC激活可以引起互斥反应。如aPC激活PAR-1后可以产生保护内皮细胞的作用，防止血管渗漏，而凝血酶激活PAR-1对内皮细胞产生破坏作用；另外，aPC的抗炎作用和凝血酶的促炎作用也都是通过激活PAR-1而产生[27]。

3 蛋白C途径的抗炎作用

血管通透性升高、炎症细胞浸润和炎症介质尤其是细胞因子的释放是所有炎性疾病的病理基础。研究显示，aPC在维持血管内皮细胞屏障功能、降低血管通透性、抑制炎症细胞浸润及调控细胞因子分泌等方面发挥重要作用[28-30]。

3.1降低血管通透性 炎症部位血管通透性升高、血液成分外泄是造成炎症部位肿胀的主要原因。研究显示，炎症部位的凝血酶活性和aPC水平升高，且aPC水平与炎症严重程度相关，而补充外源性重组人活化蛋白C可明显降低血管的通透性，减轻炎症反应[28]。对血管内皮细胞，aPC可以抑制NF-κB基因表达，减少黏附分子的表达；同时，aPC还可以调节血管内皮细胞凋亡基因抑制内皮细胞凋亡，维持血管内皮细胞稳定性，抑制血管通透性升高[28]。

进一步研究显示，凝血酶通过作用于PAR-1 N端第41位精氨酸，使PAR-1与Gq和(或)G12/13蛋白偶联，并激活致血管内皮损伤、通透性升高的信号通路，而aPC与EPCR结合后作用于PAR-1 N端的精氨酸-46，与Gi/o蛋白偶联，继而激活鞘氨醇-1-磷酸受体1和tie2[29]。aPC激活PAR-1后，β-arrestin 2和dishevelled-2 聚合可以活化Rac-1并促进内皮细胞屏障的完整[29]。有研究表明，载脂蛋白E受体2可以与EPCR共同促进细胞保护性PAR-1信号转导，促进蛋白激酶B或糖原合成酶激酶3β信号通路激活，从而保护内皮细胞免受凝血酶的破坏[30]。

3.2抑制炎症细胞迁移/趋化 在炎症细胞向炎症部位的迁移过程中，细胞表面的整合素与细胞外基质黏附，使细胞向炎症部位游走。而aPC能直接抑制内皮细胞中NF-κB的p50和p52亚基表达，使NF-κB与靶位点的结合功能降低。同时，aPC还能阻断TNF-α诱导的下游NF-κB基因的表达，如细胞黏附因子和E-选择素等，抑制炎症细胞在内皮部位的黏附作用，抑制白细胞附壁，减少炎症细胞因子渗出，从而保护血管内皮细胞[28]。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列是一个可以与整合素结合的模体，其广泛存在于多种细胞外基质黏附蛋白中，如纤维粘连蛋白、纤维蛋白原和骨桥蛋白等。氨基酸序列分析显示，在aPC重链C端的活性区域中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，可以与中性粒细胞表面的整合素β1和β3亚单位结合，改变整合素的分子构象，使整合素无法与其他黏附蛋白结合；在体外实验中，aPC可以抑制中性粒细胞的黏附和迁移作用[31]。aPC与整合素结合不需要EPCR或PAR的参与，也没有信号通路的参与。然而，野生型aPC的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列没有完全暴露在外侧，且aPC在血浆中的浓度很低(50 ng/mL)，故aPC在体内抑制中性粒细胞黏附和迁移的作用并不明显[31]。而通过调整aPC构象、调节治疗剂量或许可以增强此作用。

3.3调控致炎细胞因子的表达 参与炎症的细胞因子从功能上可分为两类：促炎症细胞因子[TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)1、IL-6等]和抗炎症细胞因子(IL-10、转化生长因子-β、IL-2等)。aPC可通过调节这两类细胞因子达到抑制炎症的目的。细胞体外培养结果显示，加入aPC后，炎症细胞因子IL-1β和γ干扰素的分泌减少，而IL-2和转化生长因子-β1分泌增加[21]。另一项大鼠实验显示，aPC治疗后大鼠血清中的TNF-α和IL-6水平降低[32]。

aPC作用于单核细胞上的PAR-1，其可以促进单核细胞中的p38促分裂原活化的蛋白激酶磷酸化，激活p38促分裂原活化的蛋白激酶途径，促使单核细胞产生并释放IL-10[33]。IL-10可以抑制多种炎症细胞因子的产生，从而达到抑制炎症的目的。另一方面，aPC能通过调节Rel同源结构域中p65/RelA在第276位丝氨酸及反式激活域第536位丝氨酸的磷酸化抑制NF-κB基因的表达[34]。此外，IL-1β、TNF-α、内毒素以及促分裂原活化的蛋白激酶信号通路可以调控膜表面的EPCR脱落，形成可溶性EPCR，从而抑制aPC的功能[12]。

4 蛋白C途径在自身免疫性疾病炎症中的作用

蛋白C途径已被证实参与了多种炎性疾病的发生和发展，其在自身免疫性疾病的作用也逐渐被发现，如炎性肠病、类风湿关节炎、糖尿病及实验性变态反应性脑脊髓炎等。同时，一些动物模型实验也证实aPC对一些炎性疾病症状的控制有较好作用[35-37]。

4.1炎性肠病 炎性肠病患者的凝血系统紊乱，患者处于凝血过快的血栓前状态。临床上，炎性肠病一般分为两种：溃疡性结肠炎和克罗恩病。有研究证实，溃疡性结肠炎和克罗恩病患者的血清蛋白C、血栓调节蛋白及蛋白S增多，这表明蛋白C和aPC未能与肠黏膜微血管有效结合[38]。故蛋白C系统功能不足，可能是导致血栓前状态和炎症反应的原因之一[38]。同时，微血管血栓可以导致肠黏膜缺血，从而进一步引起黏膜损伤。有研究发现，活动性炎性肠病患者结肠黏膜微血管和肠微血管内皮中EPCR的表达减少，这可能由于炎症细胞因子的增加所致[35]。另外，aPC功能降低引起的内皮屏障稳定作用减弱、白细胞聚集和炎症因子渗出等因素均影响着炎性肠病的发展[35]。小鼠实验结果显示，UC小鼠模型的蛋白C途径被抑制，且结肠炎症程度与蛋白C活性呈负相关，其机制可能为由巨噬细胞分泌的促炎症细胞因子影响血管内皮细胞功能，进而抑制蛋白C途径[35]。可见，蛋白C途径或许可以成为炎性肠病发病机制及治疗研究的新方向。

4.2类风湿关节炎 类风湿关节炎是一种慢性炎症性疾病，累及多个关节滑膜，可导致关节损伤。类风湿关节炎患者体内的TNF-α表达上调，NF-κB信号途径激活是类风湿关节炎疾病发展的重要机制之一。而aPC对TNF-α及NF-κB途径有明显的抑制作用。有研究显示，类风湿关节炎患者关节滑液中的aPC和基质金属蛋白酶2水平升高，且与健康人相比，类风湿关节炎患者成纤维细胞和单核细胞中生成的MMP-9更多[32]。基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9通过促进血管生成和直接降解软骨基质，在关节软骨降解中起关键作用。因此，在类风湿关节炎中aPC可以抑制炎症反应，并间接调节关节软骨组织的重构。

4.3糖尿病 1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，其能引起胰岛β细胞的破坏，减少胰岛素的生成。在非肥胖糖尿病小鼠模型中，aPC的应用增加了调节性T细胞的比例，抑制了T细胞的分化和炎症细胞因子IL-1β及γ干扰素的产生，减轻了胰岛的炎症反应，在1型糖尿病中起保护作用[36-37]。1型糖尿病可以导致肾脏损伤，最终可能达到终末期肾衰竭。而aPC在小鼠慢性肾损伤模型中有保护作用[39]。糖尿病相关的胰岛素信号受损导致内质网信号转导抑制，而aPC对内质网标志物和线粒体的影响，与内质网功能密切相关[40]。实验显示，aPC可以通过对内质网的重编程补偿胰岛素信号的缺陷，从而减轻对肾脏的损伤[41]。

4.4实验性变态反应性脑脊髓炎/多发硬化 多发性硬化是一种以中枢神经系统病变为主的自身免疫性疾病，实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型是多发性硬化的模拟动物模型。有学者对实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型进行研究发现，脑内调节性T细胞和IL-10分泌的增加、脊髓白细胞浸润减少、小胶质细胞活化减少抑制了蛋白C和aPC，并导致血脑屏障的通透性升高[42]。在实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型中，aPC的应用虽然可以调节疾病的严重程度，但对缓解率和病程无明显影响[42]。其主要原因为aPC抑制了脾脏和淋巴结中免疫细胞的增殖，减少了炎症细胞因子IL-17、TNF-α等的分泌，从而减轻了炎症细胞因子对中枢神经的损伤。此外，aPC对NF-κB信号通路的抑制也对神经细胞起保护作用。研究发现，aPC对中枢神经线粒体功能和髓鞘形成有不可或缺的作用[43]。

5 小 结

aPC的抗凝血及抗炎作用在多种疾病中起保护作用，尤其是炎症损伤性疾病。在多种动物模型中，aPC的应用对疾病的缓解有积极作用，且其安全性问题已通过基因工程变构体解决。因此，对aPC及其相关受体EPCR和PAR在各类疾病中的研究或许可以为一些疾病提供新的诊断及病程监测指标或治疗方案。然而，还有一些问题有待解决，如aPC调节免疫系统的分子机制和aPC抵抗对疾病的影响等尚不明确，且新型变异体的有效性及安全性还需进一步验证。