血清维生素D水平与体外受精-胚胎移植长方案新鲜周期妊娠结局的相关性研究

王馥新，高靓，石燕，李红*

(1. 南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院本部生殖与遗传中心，苏州 215000； 2. 南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院本部检验科，苏州 215000)

维生素D(vitamin D，Vit D)是一种脂溶性维生素，主要调节人体钙磷平衡，促进骨矿化。它有VitD2和VitD3两种形式，其中VitD3占人体总量的90%～95%。在紫外线的作用下，皮肤中的7-脱氢胆固醇转化为前体VitD3，然后在体内迅速转化为VitD3。这种VitD3无活性，需经两次羟基化才有生物学活性。在肝脏第1次羟基化，产生25(OH)D3，在肾脏经1α羟化酶发生第2次羟基化，产生生物活性代谢物1，25(OH)2D3。近年来越来越多的证据表明，维生素D除了经典的调节骨骼钙磷代谢的作用外，也存在其他作用。

研究发现，人体卵巢、胎盘、子宫内膜均含有1α羟化酶[1]，能代谢合成有活性的1，25(OH)2D3；同时，卵巢颗粒细胞[2-3]、子宫内膜细胞、子宫蜕膜[4]、胎盘[4-5]、输卵管上皮细胞及垂体[6]均存在维生素D受体(VDR)。维生素D在生殖领域的功能日益受到重视。动物实验表明，维生素D缺乏的小鼠，其卵母细胞成熟受阻、子宫发育不全，不孕症及妊娠期并发症发生率增加[7-9]。近年来，在IVF领域，维生素D对妊娠结局的影响也备受关注，但目前争议较多，未达成共识。本研究旨在探讨HCG日次日患者血清维生素D水平与IVF新鲜周期妊娠结局的相关性，探讨维生素D能否作为预测IVF妊娠率的指标。

资料与方法

一、研究对象

选取2017年3月至2018年2月在苏州市立医院本部生殖中心因输卵管因素接受IVF/ICSI长方案治疗并新鲜周期移植、年龄<35岁的不孕症患者，共147例。排除PCOS、卵巢功能减退、子宫内膜异位症、子宫腺肌症、高泌乳素血症、子宫畸形、甲状腺功能异常等其他内分泌疾病及全身疾病。

二、分组

1.按维生素D水平分组：按目前国际普遍接受的北美内分泌协会对维生素D缺乏状态的定义[10]，由25羟化酶在肝脏代谢为25羟维生素D[25(OH)D]是血液循环中浓度最高的维生素D衍生物，包括25(OH)D2和25(OH)D3，因其不受摄取的钙的量所影响，而且半衰期长，故可代表体内维生素D的状态，被认为是评价体内维生素D水平的最佳指标。若测出的总25(OH)D值≥30 ng/ml(75 nmol/L)，说明维生素D充足；如<20 ng/ml(50 nmol/L)说明维生素D缺乏；总25(OH)D值介于20～30 ng/ml之间，定义为维生素D不足。依此标准，将纳入患者分为3组。

2.按季节分组：因人体血清维生素D水平主要与日照强度相关，进一步将纳入人群按冬、春、夏、秋四季分组。

3.按妊娠结局分组：为进一步比较血清维生素D与IVF新鲜周期妊娠结局的影响，按临床妊娠结局分为妊娠组及未妊娠组。

三、促排卵及胚胎移植回顾

自月经第3天口服避孕药(达英-35，拜耳，德国)15 d，皮下注射短效GnRH-a(达必佳，辉凌制药，瑞士)，降调14 d；根据血清FSH、LH、E2、孕酮(P)水平，及阴道B超监测窦卵泡情况，符合降调标准者(FSH<5 U/L，最大窦卵泡平均直径<5 mm)开始给予促性腺药物刺激，至少3个卵泡直径≥16 mm时，当晚注射重组人HCG(艾泽，默克雪兰诺，德国)250 μg；36 h后行经阴道穿刺取卵术。所有患者均于取卵次日起每日肌注黄体酮60 mg支持黄体。取卵后3 d，若患者无明显OHSS征象，当日在超声引导下移植D3胚胎1～2枚。移植后12 d抽血检测β-HCG，阳性者于移植后25 d行阴道B超检查，见胎心搏动为临床妊娠。

于HCG日次日清晨空腹静脉采血，采用雅培Abbott ARCHITECT i2000sr自动免疫分析仪(雅培，美国)，化学发光微粒子免疫分析法测定血清25(OH)D水平。

四、观察指标

比较各组间年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础内分泌等一般情况；获卵数、MII卵率、优胚率、移植胚胎数等实验室指标；Gn总天数、Gn总剂量、移植日子宫内膜厚度、获卵数、临床妊娠率、早期流产率、异位妊娠率等临床指标。

五、统计学方法

结 果

一、不同血清维生素D水平组比较

出于分组标准，三个水平组间的血清维生素D水平有统计学差异(P<0.05)；三组间患者平均年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH、基础LH、基础E2、AMH均无统计学差异(P>0.05)；三组间胚胎实验室指标(获卵数、MII卵率、优质胚胎率、移植胚胎数)均无统计学差异(P>0.05)；三组间妊娠结局相关指标(临床妊娠率、异位妊娠率、活产率)亦均无统计学差异(P>0.05)；早期流产率绝对数值随维生素D水平升高而降低，但无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同血清维生素D水平组间一般情况及妊娠结局比较[(-±s)，%]

注：与其他两组比较，*P<0.05

二、按季节分组比较

因人体内90%的维生素D来源于光照后皮肤的转化，苏州地处长江中下游平原，一年中日照呈现四季变化，季节因素是影响维生素D水平的主要因素。因此进一步按四季分组比较。各季节组间患者一般资料无统计学差异(P>0.05)；冬季及春季患者维生素D水平显著低于夏秋季(P<0.05)，冬季组临床妊娠率绝对数值较低，但各组患者间临床妊娠率、流产率、异位妊娠率等妊娠结局相关指标均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

三、按临床妊娠结局分组比较

按临床妊娠结局，分为妊娠组(79例)和非妊娠组(68例)。两组间HCG次日血清维生素D水平无统计学差异(P>0.05)；同时，两组在年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH、LH、E2、AMH等一般情况均无统计学差异(P>0.05)；促排卵天数、药物总剂量、获卵数、移植日内膜厚度均无统计学差异(P>0.05)；妊娠组优质胚胎率数值上高于未妊娠组，但无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表2 按季节分组各组一般情况及临床结局比较[(-±s)，%]

注：与夏、秋组比较，*P<0.05

表3 妊娠组与未妊娠组一般情况比较[(-±s)，%]

讨 论

维生素D在女性生殖生理中发挥着重要作用，国内外关于维生素D与IVF临床妊娠结局相关性研究较多，但结论不一。Ozkan等[11]对84例接受IVF治疗的不孕妇女的研究发现，血清和卵泡液中的维生素D水平高者，胚胎种植率及临床妊娠率均高，卵泡液中维生素D含量每增加1 ng/ml，临床妊娠率增加6%，作者认为维生素D是预测IVF周期成功的独立因素。Budick等[12]回顾性分析了99例供卵冻融胚胎移植周期，维生素D含量充足的患者临床妊娠率高于维生素D缺乏者，推测维生素D可能是通过影响子宫内膜容受性而影响临床妊娠率。一项对188名接受IVF治疗的患者的回顾性研究显示，美国非西班牙裔白种人中，血清维生素D水平与妊娠结局正相关，而在亚裔患者中无明显相关性[13]。然而，Franasiak等[14]研究了移植优质囊胚的患者中血清维生素D水平与妊娠结局的关系，提示两者不相关。Aleyasin等[15]则认为高水平维生素D与IVF妊娠结局呈负相关，卵泡液维生素D水平较高患者获卵数略增加，其胚胎质量却较维生素D水平低者更差。

我中心HCG日扳机后12 h常规留取患者血清测定激素变化情况，因此本研究中选取此日同时留取的患者血清测定血清维生素D水平，在不增加患者痛苦的同时，该日血清维生素D水平与取卵日及胚胎移植日的血清维生素D水平更接近，更具参考意义。我们按国际普遍接受的北美内分泌协会维生素D分组标准，将输卵管因素接受IVF治疗的患者分为“维生素D缺乏组”、“维生素D不足组”、“维生素D充足组”，比较发现年龄<35岁、因输卵管因素行IVF助孕患者中，维生素D充足者仅占24.48%，维生素D缺乏状态较为普遍。苏州地区，不同季节，患者体内维生素D 水平呈现较大波动，冬春季节因日照较少，维生素D水平较低。无论是根据北美内分泌协会维生素D营养状态分组，还是按季节进行分组，各组患者间一般情况相似，具有可比性，然而组间成熟卵率、优质胚胎率、临床妊娠率、异位妊娠率等指标，差异均无统计学意义。

值得注意的是，本研究数据提示早期流产率绝对值随维生素D水平升高而逐渐降低，维生素D缺乏组为9.34%，维生素D不足组为4.41%，维生素D充足组为2.78%。维生素D能作用于子宫内膜VDR，上调着床相关基因如HOXA10表达[16]。徐士儒等[17]研究发现，维生素D能降低复发性流产患者外周血NK细胞毒性，降低复发性流产患者流产率。有文献报道，维生素D能调节母胎界面免疫状态，使局部免疫平衡从TH1向TH2倾斜，有利于妊娠的维持[18]。这可能是早期流产率随维生素D水平增高而降低的原因。但遗憾的是，由于本研究样本量较小，早期流产率在不同维生素D水平组并无统计学差异。

上述分组标准参照的是北美内分泌学会的建议，主要适用于评价骨质疏松、钙磷代谢的状态，在不孕症人群中是否适用，目前尚无证据。因此，我们进一步按临床妊娠结局分为“临床妊娠组”及“未妊娠组”，两组年龄、体重指数、不孕年限、基础内分泌等背景情况相似，但两组HCG日次日血清维生素D水平分别为(24.05±7.59)ng/ml、(25.27±7.10)ng/ml，十分接近。较多证据表明维生素D缺乏可能与PCOS和子宫内膜异位症的发病相关。维生素D参与胰岛素代谢，维生素D缺乏会引发胰岛素抵抗，因此维生素D缺乏可能会导致PCOS的发生[19]。同时，维生素D具有免疫调节及抗炎功能，参与子宫内膜异位症的发生发展。体外实验结果显示，1，25(OH)2D3能上调IL-8及前列腺素的表达，进而显著对抗IL-1β及TNF-α诱导的炎症反应，对抗子宫内膜异位症患者局部的免疫异常[20]。本研究的研究对象为仅为输卵管因素所致不孕的年轻女性，不包含PCOS和子宫内膜异位症患者，因而可能输卵管因素人群妊娠结局与维生素D缺乏状态关联性较小，导致“妊娠组”与“未妊娠”组间维生素D水平不存在差异。

卵泡液中25(OH)D水平较外周血循环更能反映卵泡局部微环境的情况，但目前结果也不一致。Antunes等[21]认为卵泡液中维生素D水平越低，卵母细胞质量越好；Farzadi等[22]则认为，卵泡液中维生素D水平与IVF种植率及IVF妊娠结局呈正相关。而另有学者认为无论血清维生素D抑或卵泡液维生素D水平与IVF妊娠结局均不存在相关性[23]。以上这些学者测定的均是25(OH)D，然而卵巢局部或是子宫内膜局部有活性的1，25(OH)2D3水平更能直接说明维生素D对妊娠结局的影响，但目前对于1，25(OH)2D3尚无很好的检测手段。本研究中未能测定卵泡局部的维生素D水平，且目前尚缺乏有效手段检测维生素D活性产物1，25(OH)2D3的水平，这也是造成本研究中维生素D水平对组间妊娠结局无影响的可能因素。

此外，最近两篇荟萃分析结果提示，血清维生素D水平不影响IVF临床妊娠率，但维生素D缺乏患者其持续妊娠率和活产率低于维生素D充足者[24]。维生素D本身参与调节胎盘功能，参与妊娠[25]。本研究中因部分患者尚无最终妊娠结局，未能比较组间最终活产率的差异。但检索现有文献，未查询到比较血清维生素D水平在IVF受孕妇女及自然受孕妇女间对围产结局的影响。我们推测维生素D水平可能与妊娠本身相关，对妊娠中晚期的影响更大，而与IVF这项技术本身关联性较小，但仍需进一步深入探讨。

综上所述，本研究结果提示，HCG日次日血清维生素D水平与因输卵管因素行IVF新鲜移植周期妊娠结局不相关，无法预测其妊娠结局。但由于研究对象病因及样本量的局限性，对维生素D与IVF妊娠结局的影响仍需更多更深入的研究。