液基细胞学检测联合P16/Ki67蛋白、血清SCCA和CA125检测对宫颈癌早期筛查的诊断价值

任莹 丛玲华 何喻 方来福

[摘要] 目的 探討液基细胞学检测联合P16/Ki67蛋白表达以及血清SCCA和CA125的水平在宫颈癌早期诊断中的价值。 方法 患者宫颈脱落细胞采用液基细胞学检测和P16/Ki67单克隆抗体CINtec PLUS双染法检测P16/Ki67蛋白，放射免疫法检测患者血清SCCA和CA125水平，依据液基细胞学和病理活检结果进行分组，应用ROC曲线分析液基细胞学检测和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法对宫颈癌的早期诊断价值，同时比较分析血清SCCA和CA125的水平在宫颈癌早期诊断中的价值。 结果 非典型的鳞状细胞异常ASC-US中病理学CIN1的所占比例较高，差异具有显著性（P<0.05）。液基细胞学检测结果非典型的鳞状细胞异常各分型和病理学结果有差异（P<0.05），液基细胞学结果分类ASC-US和ASC-H与病理结果有一致性。鳞状上皮病变各分型和病理学结果有差异（P<0.05），液基细胞学结果分类LSIL和HSIL和病理结果也有一致性。液基细胞学检测和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法具有一致性，但CINtec PLUS双染法灵敏度和特异度均高于液基细胞学检测。两法的平行并联试验与金标准的一致性较好，灵敏度和约登指数较两者单独试验要高，串联可提高特异度。SCCA和CA125的单独或联合敏感度和特异度均低于液基细胞学检测和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法。 结论 P16/Ki67蛋白检测和官颈液基细胞学检查联合具有更高的灵敏度，在宫颈癌早期临床筛查工作中具有临床应用价值。

[关键词] 液基细胞学;宫颈癌;P16/Ki67;SCCA;CA125

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）36-0120-05

Diagnostic value of liquid-based cytology combined with P16/Ki67 protein and serum SCCA and CA125 in early screening for cervical cancer

REN Ying   CONG Linghua   HE Yu   FANG Laifu

Department of Pathology， Ningbo Yinzhou People's Hospital， Ningbo   315040， China

[Abstract] Objective To investigate the value of liquid-based cytology combined with P16/Ki67 protein expression and serum SCCA and CA125 levels in early diagnosis of cervical cancer. Methods Cervical exfoliated cells were detected by liquid-based cytology. P16/Ki67 protein was detected by P16/Ki67 monoclonal antibody CINtec PLUS double staining method. The serum levels of SCCA and CA125 were detected by radioimmunoassay. And the patients were grouped according to liquid-based cytology and pathological biopsy. The ROC curve was used to analyze the early diagnosis value of liquid-based cytology and P16/Ki67 protein CINtec PLUS double staining method in the early diagnosis of cervical cancer. At the same time， the early diagnosis value of serum SCCA and CA125 levels in cervical cancer was compared. Results The proportion of pathological CIN1 in atypical squamous cell abnormalities ASC-US was significantly higher， and the difference was significant（P<0.05）. The results of liquid-based cytology showed that there were differences in the classification and pathological results of atypical squamous cell abnormalities（P<0.05）. The results of liquid-based cytology ASC-US and ASC-H were consistent with pathological results. The classification and pathological results of squamous epithelial lesions were different（P<0.05）， and the results of liquid-based cytology classification LSIL and HSIL were consistent with pathological results. The liquid-based cytology test was consistent with the P16/Ki67 protein CINtec PLUS double staining method， but the sensitivity and specificity of the CINtec PLUS double staining method were higher than those of the liquid-based cytology. The parallel test of the two methods was in good agreement with the gold standard， and the sensitivity and the Yoden index were higher than the two separate tests. The series connection could improve the specificity. The sensitivity or specificity of SCCA and CA125 alone or in combination was lower than that of liquid-based cytology and P16/Ki67 protein CINtec PLUS double staining. Conclusion The combination of P16/Ki67 protein detection and cervical liquid-based cytology has higher sensitivity and has clinical value in early clinical screening of cervical cancer.

[Key words] Liquid-based cytology; Cervical cancer; P16/Ki67; SCCA; CA125

在全球宫颈癌仍然是威胁女性健康的恶性肿瘤，在肿瘤发病排序中占第2位，死亡率占第3位，发展中国家其发病率居第1位。2012年新报告宫颈癌约527 600例，死亡265 700例，占女性新发癌症病例的15%[1]。日本学者报道妊娠中最常见的恶性肿瘤依次为宫颈癌、乳腺癌和卵巢癌[2]。目前低收入和中等收入国家的宫颈癌死亡率仍然很高，早期筛查、宫颈癌了解以及疾病风险知识的了解非常重要[3]。宫颈癌的微创根治性子宫切除术与IA2期或IB1期宫颈癌开放手术相比，总体生存期更短[4]。为进一步提高宫颈癌早期诊断，获得更好的临床治疗效果和生存时间，寻求宫颈癌发生发展中早期敏感指标，对于阻断早期宫颈癌癌前病变的发展、减少宫颈癌继续发展十分必要。基于此本研究旨在应用液基细胞学检测（Liquid-based cytology，LBC）联合P16/Ki67蛋白分析对早期宫颈癌的诊断价值，探讨LBC检测联合P16/Ki67蛋白以及血清肿瘤标记物的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料

收集宁波市鄞州人民医院2015年1月～2018年12月300例患者行宫颈病理学活检标本，满足纳入标准：年龄大于25岁以上的女性;如姓名、年龄和病史等信息完整;同时有宫颈活检结果又有有效宫颈脱落细胞，并附有一份完整的临床病理数据。排除孕妇、产妇及哺乳期妇女、样本不全、标本信息不全和不符合年龄要求者。患者平均年龄（54.15±15.41）岁，根据病理学检查结果，分析LBC标本结果和病理检查的一致性，总计300例，按组织病理学分级分为：慢性宫颈炎139例、CIN1 71例、CIN2 34例，CIN3 13例、宫颈癌43例。接受术前化疗或放疗排除在本研究之外。本研究试验程序或研究方案经宁波市鄞州人民医院伦理学委员会批准，获得知情同意并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

液基细胞制片染色系统（Liquid-based Cytology Test，LBCT）为广州安必平医药科技有限公司生产。P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法试剂盒购自英国abcam公司。SCCA和CA125采用美国全自动生化仪进行检测。

1.3 方法

1.3.1 液基细胞学标本采集和处理  患者取膀胱截石位，阴道窥器充分暴露宫颈，医生将细胞刷放入宫颈口，在宫颈癌好发部位即子宫颈移行带顺时针旋转360°，刮取子宫颈细胞，将宫颈刷放入以甲醇为主要成分的细胞保存液中刷洗，收集宫颈脱落细胞在保存液中。细胞标本瓶进行标本核对、编号后，应用广州安必平医藥科技有限公司的LBCT 进行自动化移液及梯度离心，细胞沉降，制成一个直径 1.3 cm 的细胞薄层，自动染色，染色方法为巴氏染色。依据子宫颈细胞学 Bethesda 报告系统发报告，先进行标本质量评估，然后判读。

1.3.2 免疫组织化学染色及结果判断标准  应用免疫组化高敏感的P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法试剂盒说明书进行操作，显示P16INK4棕色染色定位在细胞浆中，显示Ki67红色染色定位在细胞核内。根据宫颈Bethesda诊断报告系统指南2009年版或TBS来评估样本的充分性。结果判读：阳性：一个或多个宫颈上皮细胞在同一细胞中同时存在特异性棕色和红色染色。阴性：无宫颈上皮细胞出现特异性棕色和红色染色，或存在仅对一种而非两种标记物有免疫染色，或存在对两种标记物有反应性的宫颈上皮细胞，但两种染色不是在同一细胞内。

1.3.3血清学SCCA和CA125检测  入院患者清晨空腹抽取静脉血4 mL，置凝胶促凝管管内以3000 r/min的转速离心7 min后分离血清，采用放射免疫法检测血清CA125和SCCA。结果判定标准：SCCA>2.5 ng/mL、CA125>35 U/mL为阳性。

1.3.4 ROC曲线分析  根据病理检查结果结合临床资料，分为阴性组和阳性组，LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法采用灵敏度为纵坐标，假阳性率（1-特异度）横坐标绘制ROC曲线并计算曲线下面积。SCCA和CA125分别判断对早期宫颈癌特异性和敏感性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，计数资料以百分比（%）表示，采用χ2检验。应用ROC曲线分析特异性和敏感性。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 LBC后行病理活检的患者结果

在对LBC结果和病理活检结果比较发现，非典型的鳞状细胞异常中ASC-US中病理学结果CIN1的所占比例较高，差异具有显著性（P<0.05）。鳞状上皮病变LSIL中病理学结果CIN2、CIN3以及癌虽然无显著性差异，仍占有少量的比例。见表1。

2.2 LBCT结果对早期宫颈癌的诊断价值

LBC结果提示非典型的鳞状细胞异常各分型和病理学结果有差异（P<0.05），LBC结果分类ASC-US和ASC-H与病理结果有一致性。鳞状上皮病变各分型和病理学结果有差异（P<0.05），LBC结果分类LSIL和HSIL与病理结果也有一致性。见表2。

2.3 LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法分析比较

LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法和病理学结果比较，CINtec PLUS双染法结果一致性非常好，LBC法一致性较好。CINtec PLUS双染法灵敏度和特异度均高于LBC检测，见表3。LBC和CINtec PLUS双染法一致性较好（Kappa=0.550，P>0.05）。见表4。

Kappa≥0.75两者一致性非常好;0.75>Kappa≥0.4两者一致性较好;Kappa<0.4两者一致性较差。

通过平行试验（并联）（该法提高灵敏度，但有可能降低特异度）：即只要有一个试验结果阳性，即可判读为阳性。两者试验结果均为阴性，才可判读为阴性。系列试验（串联）（提高特异度，但有可能降低灵敏度）：只要有一个试验结果为阴性，即可判读为阴性。两者试验结果均为阳性，才可判读为阳性。CINtec PLUS双染法和宫颈LBCT作为宫颈癌及癌前病变的筛查试验，其主要的胎床作用是提高诊断的灵敏度。根据以上数据显示，两者的平行并联试验的Kappa值大于0.4，其與金标准的一致性较好，且其灵敏度和约登指数均较两者单独试验要高，认为其对临床筛查宫颈癌及癌前病变具有实际应用价值。见表5。

2.4 LBC、P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法以及SCCA和CA125对早期宫颈癌诊断的价值比较

CINtec PLUS双染法早期宫颈癌诊断的敏感性比较好，两者并联联合试验的灵敏度提高，但特异度降低，而两者的串联可提高特异度。SCCA和CA125的单独或联合敏感度和特异度均低于LBCT和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法。见表6和封三图7。

3讨论

高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）的检测在宫颈癌高危人群的筛查中发挥很重要的作用，研究报道LBC中非典型腺细胞如低肿瘤细胞性和低级柱状形态的细胞和组织学的腺癌有很大关联，并且73%的腺癌HR-HPV阳性，HPV检测结果阴性的偶发病例仍值得关注[5]。P16（基因位点：9p21）肿瘤抑制基因被认为是各种恶性肿瘤和癌前病变进展和预后的重要生物标志物，包括高危HR-HPV介导的鳞状上皮内病变（SILs）、基于细胞学和相应的宫颈上皮内瘤变（CIN）。P16作为细胞周期蛋白依赖性激酶-4抑制剂，负调节细胞周期，在持续性HPV感染中，E7致癌蛋白结合视网膜母细胞瘤蛋白导致其蛋白水解转化，也引发E2F解离，其增加DNA转录并进展至S期，促进异常的P16过表达，LBC LSIL/HSIL病例与P16过表达高度相关，同时能反映更高的CIN诊断[6]。本观察通过LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法联合比较对早期宫颈癌的价值，P16/Ki67蛋白检测和宫颈LBC联合具有更高的灵敏度。

回顾性分析300 800个宫颈癌和癌前病变（CIN3/AIS）在获得明确诊断之前的筛查历史评估成像LBC和HPV测试提示，LBC发现更多女性随后被诊断出患有宫颈癌和CIN3/AIS，而不是HPV检测[7]。并且LBC在鳞状细胞癌的复发诊断后治疗的检测上优于传统的细胞学，其灵敏度、特异性和准确性远高于传统方法[8]。本观察发现LBC提示非典型的鳞状细胞异常ASC-US类型中病理学结果CIN1的所占比例较高，各分型和病理学结果有差异，LBC分类ASC-US和ASC-H与病理结果有一致性。鳞状上皮病变各分型和病理学结果有差异，LBC分类LSIL和HSIL和病理结果有一致性。另外关于P16表达在ASC-US、LSIL、HSIL和SCC报道的阳性率分别为21.1%、39.0%、67.7%和85.4%[9]，宫颈癌普查中发现，使用活组织检查作为金标准，P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法和LBC显示相似的敏感性，但特异性较高[10]，本观察LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法具有一致性，但CINtec PLUS双染法灵敏度和特异度均高于LBC，和上述文献报道结果一致，在癌前病变和恶性宫颈病变中检测到紧密连接蛋白claudin-1（CLDN1）的表达增加，近来有学者通过组织学为对照，平行P16/Ki67和CLDN1/Ki67双染色细胞学的比较发现两者在LBC样品和组织切片上证明灵敏度和特异性相似[11]。故以后的宫颈癌高危筛查中可能高HR-HPV检测的同时，引入LBC联合P16/Ki67双染有比较好的临床实用价值。

基于上述的结果，本观察通过两法的平行并联试验与金标准的一致性较好，且其灵敏度和约登指数较两者单独试验要高，两者的串联可提高特异度。故在临床中应该结合应用，提高早期宫颈癌的筛查效果，本观察同时比较妇科肿瘤临床普遍应用的血清SCCA和CA125的临床诊断价值，提示单独或联合敏感度和特异度均低于LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS双染法。Papanicolau（Pap）试验是用于早期检测宫颈上皮发育不良病变的常规细胞学方法，后来发现P16和Ki67生物标志物作为诊断HR-HPV相关发育异常的辅助工具，以通过额外的比色特征补充细胞的形态特征[12]，发现无病变或轻微异常的HPV 16/18阳性妇女进展为HSIL/CIN2+的风险很高[13]。这表明临床上要在LBC联合P16/Ki67双染的必要性和早期诊断中的价值。后来应用新的液相色谱-质谱技术检测HSIL相关代谢物与有HPV感染和无HPV感染的女性宫颈病变进行比较，发现HSIL的形成似乎影响神经酰胺合成酶途径，改变细胞调节和增加细胞鞘氨醇碱浓度（如二甲基二氢鞘氨醇）[14]。

综上所述，随着生物学技术的发展，关于标志性的生物学标记物是否改变细胞的生物学行为成为关键点。寻求有效的标记物可以提供新的分类诊断模型，可以更好地阐明和区分疾病表型而不是其基因型。相信在寻找宫颈癌诊断生物标志物时，已经从宫颈组织、肿瘤组织和宫颈细胞学中进行了蛋白质组学含量的研究[15]、使用尿液[16，17]或血浆和血清样品的阶段[18-20]。经过适当的方法验证和优化，专注于已知的预测标记，实现快速自动化以便更好地应用于临床服务显得更为重要。

[参考文献]

[1] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin， 2015，65（2）：87-108.

[2] Kobayashi Y，Tabata T，Omori M，et al. A Japanese survey of malignant disease in pregnancy[J]. International Journal of Clinical Oncology，2019，24（3）：328-333.

[3] Choi Y，Oketch SY，Adewumi K，et al. A Qualitative Exploration of Women's Experiences with a Community Health Volunteer-Led Cervical Cancer Educational Module in Migori County，Kenya[J]. Journal of Cancer Education，2018.

[4] Melamed A，Margul DJ，Chen L，et al. Survival after Minimally Invasive Radical Hysterectomy for Early-Stage Cervical Cancer[J]. The New England Journal of Medicine， 2018，379（20）：1905-1914.

[5] Conrad RD，Liu AH，Wentzensen N，et al. Cytologic patterns of cervical adenocarcinomas with emphasis on factors associated with underdiagnosis[J]. Cancer Cytopath-ology，2018，126（11）：950-958.

[6] Tsiambas E，Riziotis C，Mastronikolis NS，et al. Comparative p16（IKN4A）Expression in Laryngeal Carcinoma and Cervical Cancer Precursors：A Real-time Grid-based Immunocytochemistry Analysis[J]. Anticancer Research，2018，38（10）：5805-5810.

[7] Austin RM，Onisko A，Zhao C. Enhanced Detection of Cervical Cancer and Precancer Through Use of Imaged Liquid-Based Cytology in Routine Cytology and HPV Cotesting[J]. American Journal of Clinical Pathology，2018，150（5）：385-392.

[8] Singh U，Anjum，Qureshi S，et al. Comparative study between liquid-based cytology & conventional Pap smear for cytological follow up of treated patients of cancer cervix[J]. The Indian Journal of Medical Research，2018， 147（3）：263-267.

[9] Mishra S，Husain N，Awasthi NP，et al. Liquid-based cytology：do ancillary techniques enhance detection of epithelial abnormalities？[J]. Archives of Gynecology and Obstetrics， 2018，298（1）：159-169.

[10] Arean-Cuns C，Mercado-Gutierrez M，Paniello-Alastruey I，et al. Dual staining for p16/Ki67 is a more specific test than cytology for triage of HPV-positive women[J]. Virchows Arch，2018，473（5）：599-606.

[11] Szekerczes T，Galamb A，Kocsis A，et al. Dual-Stained Cervical Cytology and Histology with Claudin-1 and Ki67[J]. Pathology Oncology Research，2019，25（2）：477-486.

[12] Gertych A，Joseph AO，Walts AE，et al. Automated detection of dual p16/Ki67 nuclear immunoreactivity in liquid-based Pap tests for improved cervical cancer risk stratification[J]. Annals of Biomedical Engineering，2012， 40（5）：1192-1204.

[13] Rodriguez-Trujillo A，Marti C，Angeles MA，et al. Value of HPV 16/18 Genotyping and p16/Ki-67 Dual Staining to Predict Progression to HSIL/CIN2+ in Negative Cytologies From a Colposcopy Referral Population[J]. American Journal of Clinical Pathology，2018，150（5）：432-440.

[14] Porcari AM，Negrao F，Tripodi GL，et al. Molecular Signatures of High-Grade Cervical Lesions[J]. Frontiers in Oncology，2018，8：99.

[15] Escobar-Hoyos LF，Yang J，Zhu J，et al.Keratin 17 in premalignant and malignant squamous lesions of the cervix：proteomic discovery and immunohistochemical validation as a diagnostic and prognostic biomarker[J]. Modern Pathology，2014，27（4）：621-630.

[16] Chen Y，Xu J，Zhang R，et al. Assessment of data pre-processing methods for LC-MS/MS-based metabolomics of uterine cervix cancer[J]. The Analyst，2013，138（9）： 2669-2677.

[17] Mu AK，Lim BK，Aminudin N，et al. Application of SELDI-TOF in N-glycopeptides profiling of the urine from patients with endometrial，ovarian and cervical cancer[J]. Archives of Physiology and Biochemistry，2016，122（3）：111-116.

[18] Yin MZ，Tan S. Identification of phosphatidylcholine and lysophosphatidylcholine as novel biomarkers for cervical cancers in a prospective cohort study[J]. Tumour biology：the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine，2016， 37（4）：5485-5492.

[19] Liu Y，Wei F，Wang F，et al.Serum peptidome profiling analysis for the identification of potential biomarkers in cervical intraepithelial neoplasia patients[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2015，465（3）：476-480.

[20] Yang K，Xia B，Wang W，et al. A Comprehensive Analysis of Metabolomics and Transcriptomics in Cervical Cancer[J]. Scientific Reports，2017，7：43353.

（收稿日期：2019-04-17）